孕激素受体及抗体概述

孕激素受体（PR）是由PGR基因编码的核激素受体。与配体结合后，PR转位至细胞核，作为转录因子调控参与生殖生物学、乳腺发育及子宫功能的相关基因。PR-A和PR-B两种主要亚型由同一基因内不同启动子的差异使用产生，具有不同的转录活性。

PR的免疫检测在乳腺癌及子宫内膜癌病理诊断中具有重要临床意义，PR状态可指导激素治疗方案的制定。Progesterone Receptor Mouse mAb（Ab349219，内部编码absea#KC-1153）是一种在小鼠体内制备的单克隆抗体，对PR具有高度特异性，与结构相关的甾体激素受体交叉反应极低。

所需材料与设备

• Progesterone Receptor Mouse mAb（Ab349219）
• 适配二抗（抗小鼠IgG，HRP或荧光素偶联）
• 已知表达PR的阳性对照组织或细胞裂解液（如MCF-7乳腺癌细胞）
• 阴性对照（PR阴性组织或同型对照抗体）
• PBS（pH 7.4）或TBS洗涤缓冲液
• 封闭缓冲液（WB用：TBST配制的5%脱脂奶粉；IHC/IF用：PBS配制的3–5%正常血清或BSA）
• IHC用抗原修复试剂（如柠檬酸缓冲液pH 6.0或EDTA缓冲液pH 9.0）
• 微波炉或压力锅/水浴锅（用于热诱导表位修复HIER）
• SDS-PAGE系统及PVDF或硝酸纤维素膜（用于WB）
• 含DAPI的封片剂（用于IF）
• DAB显色试剂盒（用于IHC）

分步操作方案

A. 免疫组化（IHC）

1. 组织处理：用10%中性缓冲福尔马林固定组织并石蜡包埋（FFPE）。切片厚度3–5 µm，贴附于正电荷载玻片。
2. 脱蜡与复水：60°C烘烤30 min，二甲苯脱蜡（3 × 5 min），梯度乙醇复水至蒸馏水。
3. 抗原修复（HIER）：将切片置于预热的柠檬酸缓冲液（pH 6.0）或EDTA缓冲液（pH 9.0）中，加热10–20 min，室温冷却20 min。
4. 灭活内源性过氧化物酶：用甲醇配制的3% H₂O₂孵育10 min；PBS洗涤3 × 5 min。
5. 封闭：室温下用3–5%正常血清（与二抗宿主物种匹配）或1% BSA/PBS封闭30–60 min。
6. 一抗孵育：按说明书推荐稀释比例施用Progesterone Receptor Mouse mAb（Ab349219），于湿盒中4°C孵育过夜。
7. 洗涤：PBS洗涤3 × 5 min。
8. 二抗：按推荐稀释比例施用HRP偶联抗小鼠IgG二抗，室温孵育30–60 min。
9. 显色：施用DAB底物，显微镜下监测显色（通常2–10 min），用水终止反应。
10. 复染与封片：苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，永久封片剂封片。

B. 蛋白质印迹（WB）

1. 样品制备：用含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞，BCA或Bradford法测定蛋白浓度，每泳道上样20–50 µg总蛋白。
2. SDS-PAGE：在8–10% SDS-PAGE凝胶上分离蛋白，转至PVDF膜（预先用甲醇活化）。
3. 封闭：5%脱脂奶粉/TBST室温封闭1 h。
4. 一抗：按说明书推荐稀释比例加入Progesterone Receptor Mouse mAb（Ab349219），4°C轻摇孵育过夜。
5. 洗涤及二抗：TBST洗涤3 × 10 min，加入HRP偶联抗小鼠IgG，室温孵育1 h。
6. 检测：TBST洗涤3 × 10 min，ECL底物显色并成像。预期条带：约94 kDa（PR-B）和/或约81 kDa（PR-A）。

C. 免疫荧光（IF）

1. 细胞制备：将细胞接种于盖玻片，4%多聚甲醛室温固定15 min，0.1–0.3% Triton X-100透化10 min。
2. 封闭：PBS配制的3–5% BSA或正常血清封闭30–60 min。
3. 一抗：按推荐稀释比例加入Ab349219，4°C孵育过夜。
4. 二抗：PBS洗涤3 × 5 min，加入荧光素偶联抗小鼠IgG，避光室温孵育1 h。
5. 核复染与封片：洗涤后加入含DAPI的封片剂，盖玻片密封，荧光显微镜成像。

问题排查

储存、操作与安全

请按照产品说明书规定的条件储存Progesterone Receptor Mouse mAb（Ab349219）。单克隆抗体的一般储存指南：短期使用（1个月内）置于4°C，长期储存置于−20°C。避免反复冻融，因为反复冻融会导致抗体变性、降低特异性活性。首次解冻时应分装，以减少冻融次数。

按照标准实验室生物安全规程操作所有生物试剂。佩戴适当的个人防护装备（PPE），包括手套、实验服和护目镜。处置指导请参阅安全数据表（SDS）。请勿使用超过有效期的试剂。