采用聚偏氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF )膜的免疫印迹技术是 Edman 测序最常用的方法。通过电转印，蛋白样品从 2D-聚丙烯酰胺（2D-PAGE)凝胶转移到 PVDF 膜上，装载蛋白的这种膜可直接用于蛋白测序。本实验来源「植物蛋白质组学实验指南」〔法〕H.蒂勒门特、M.齐维、C.达默韦尔、V.米琴主编。

操作方法

2D凝胶的蛋白Edman测序

材料与仪器

SDS 抽样缓冲液 分离胶缓冲液 浓缩胶缓冲液 SDS-PAGE 电泳缓冲液

步骤

3.1 Cleveland 肽图谱[5]

( 1 ) 样品进行 2D-PAGE 分离，然后用考马斯亮蓝（CBB ) 染色，去除含有蛋白质点的凝胶碎片。

( 2 ) 用电泳浓缩仪洗脱凝胶中的蛋白质，2W 恒功率洗脱 2 h。洗脱后，再用 MQ 水透析两天，再冻干。

a. 从 2D 胶中切下蓝色蛋白质点，用 MQ 水浸泡。

b. 在装有蛋白质点（含有 5~20 块凝胶碎片）的 2 ml 离心管中加入 750 μl 电洗脱缓冲液摇晃 30 min。

c. 将 12~15 cm 长的透析膜（小号，no.24，Wako，Osaka，Japan ) 放入 250 ml MQ 水中（用 300 ml 烧杯）煮沸 5 min。同时用 MQ 水浸湿小片玻璃纸。

d. 关闭装有透析膜的容器的小口，打开容器的大口，装上透析膜，扭转，用夹子夹住加以封闭（图 18-1A ) 。

e. 将这个容器连接在电泳浓缩仪上（图 18-1B；Nippon  Eido，Tokyo，Japan ) 。将含有蛋白的凝胶碎片放到玻璃纸上（玻璃纸连接在容器的小口上），加 750 μl 电洗脱缓冲液。在容器的两端加入电洗脱缓冲液，容器两端通过缓冲液连接起来，这样蛋白质就可以从小口玻璃纸上转移到大口的透析膜上。加入电洗脱缓冲液，装有蛋白质的小口部分要和正极连接。

f. 2W 恒功率通电跑 2 h。

g. 去除透析膜，用夹子夹住加以封闭，在 4°C 透析，第一天换水（去离子水）3 次，第二天换水（MQ 水）2 次。

h. 将蛋白质溶液置于 2~6 个 2 ml 的离心管中，冷冻干燥过夜。

i. 将蛋白溶解于 30 μl 的 SDS 抽样缓冲液中。

( 3 ) 蛋白质溶解于 20W 的 SDS 抽样缓冲液中（pH 6.8)，然后上样，进行 SDS-PAGE 凝胶电泳。将含有 10 μl 金黄色葡萄球菌 V8 蛋白酶（Pierce，Rockford，1 L )。( 0.1 μg/μl）和 10 μl SDS 抽样缓冲液（pH 6.8 ) 的溶液覆盖在蛋白质样品上。开始电泳，直到当蛋白质样品和蛋白质酶汇聚到浓缩胶时，关闭电源。30 min 消化蛋白质，然后继续电泳。

a. 用夹子固定玻璃板（100 ml X 140 mm X 1 mm ) ，玻璃板间为 1 mm 间距。

b. 在 100 ml 的烧杯中制备分离胶溶液。混合溶液，灌胶使胶面低于板上部 3 cm ( 提示：当加了 10% APS 和 TEMED 后要立即灌胶）。

c. 用 1 ml 的 MQ 水覆盖分离胶。

d. 将胶置于室温下 40~60 min 进行聚合反应。

e. 倒掉过多的水，准备灌入浓缩胶溶液。

f. 在 100 ml 的烧杯中制备浓缩胶溶液，灌入分离胶上，插入梳子。

g. 将胶置于室温下 20 min 聚合。

h. 拔出梳子，卸下夹子，去掉硅胶条。

i. 用注射器清洗加样孔。

j. 将玻璃板安装到电泳槽上，倒入 SDS-PAGE 电泳缓冲液。

k. 蛋白溶解于 20 μl SDS 抽样缓冲液中（pH 6.8)，然后上样，进行 SDS-PAGE 凝胶电泳。将含有 10 μl 金黄色葡萄球菌 V8 蛋白酶（0.1 μg/μl）和 10 μl SDS 抽样缓冲液 ( pH 6.8 ) 的溶液覆盖在蛋白质样品上，加入 30 μl 的溴酚蓝溶液。

l. 开始电泳，直到蛋白质样品和蛋白酶汇聚到浓缩胶时，关闭电源，30 min 消化蛋白质。

m. 35 mA 恒流跑电泳，直到溴酚蓝指示线到达距底部 5 mm 处。

n. 停止电泳，取出玻璃板。

o. 用抹刀分开玻璃板。

p. 去掉浓缩胶，取出分离胶。

3.2 N 端及内部氨基酸序列分析，氨基酸序列的同源比较分析

( 1 ) 经过 2D-PAGE 或 Cleveland 方法分离的蛋白通过半干转移印迹仪电转移到 PVDF 膜上（Pall，Port  Washington，USA ) ，然后通过考马斯亮蓝染色观察。

a. 剪一块 PYDF 膜，大小和胶一样。

b. 剪一块 3 MM 沃特曼滤纸，大小和胶一样。

c. 用甲醇清洗 PVDF 膜几秒钟，再将膜放入 100 ml 的印迹溶液 C 中，轻摇 5 min。

d. 分别在印迹液 A、B、C 中浸润两张印迹滤纸（3 MM) 。

e. 将分离胶放入 100 ml 印迹液 C 中，轻摇 5 min。

f. 用 MQ 水润湿半干转移印迹仪，将浸湿在印迹液 A 中的滤纸放在印迹板上，再放上浸湿在印迹液 B 中的滤纸。如有气泡应全部消除。再依次放上 PVDF 膜、分离胶和浸湿在印迹液 C 中的滤纸。

g. 接通电源，以 1 mA/cm² 的电流跑 90 min。

h. 用 100 ml 的 MQ 水清洗膜。

i. 用考马斯亮蓝染色 2~3 min。

j. 用 60% 的甲醇脱色 3 min，共两次。

k. 胶在用 MQ 水洗后，室温干燥。

( 2 ) 将染色的蛋白质点或条带从 PVDF 膜上切下，放置于气相蛋白质测序仪 Procise 494 或 cLC ( Applied  Biosystems，Foster City，CA ) 反应室的上部玻璃区域，运用 Applied  Biosystems 提供的标准程序进行 Edman 降解，得到的乙内酰苯硫脲氨基酸（PTH ) 通过在线高效液相色谱（HPLC ) 进行分离，根据保留时间进行鉴定。

( 3 ) 通过网络 FastA 程序搜索 Swiss-Prot，PIR，Genpept，PDB 数据库，得到的氨基酸序列跟数据库中已知的蛋白质进行比较分析。

3.3 印迹蛋白质的去封闭 ( 见注释 1)

1. 乙酰丝氨酸和乙酰苏氨酸

N 端含有乙酰丝氨酸和乙酰苏氨酸的蛋白质通过电转移转到 PVDF 膜上，带有蛋白的 PVDF 膜切下来后用三氟乙酸 60°C 处理 30 min，然后进行蛋白质测序（见注释 2)。

2. 甲酰化基团

甲酰化蛋白通过电转移转到 PVDF 膜上，PVDF 膜切下来后在 300 μl 0.6 mol/L HCl 溶液中在 25°C 处理 24h。之后将膜用 MQ 水洗干净，干燥完后可进行测序。

3. 焦谷氨酸

( 1 ) N 端含有焦谷氨酸的蛋白通过电转移转到 PVDF 膜上。

( 2 ) 带有蛋白的 PVDF 膜切下来后用 200 μl 100 mmol/L 的冰醋酸 [ 含 0.5% 聚乙烯吡咯烷酮碘 PVP-40 ] 在 37°C 处理 30 min ( 见注释 3) 。

( 3 ) 用 1 ml 的 MQ 水洗膜 10 次。

( 4 ) 用 100 μl 0.1 mol/L 的磷酸缓冲液（pH 8.0 ) ( 含 5 mmol/L 二硫苏糖醇和 10 mmol/L EDTA ) 浸润 PVDF   膜。

( 5 ) 加入 5 μg 焦谷氨酰肽酶后，30°C 处理 24h。

( 6 ) PVDF 膜用 MQ 水洗净，干燥后用于测序。

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