蛋白质因氨基酸序列及折叠/寡聚等高级结构差异，并受真核细胞常见翻译后修饰（如磷酸化、糖基化等）影响，呈现出不同的构象尺寸与等电点，从而改变分离过程中的迁移行为与“表观分子量”。据此，在实验中应依据应用场景选择匹配的分子量标准：原生条件下使用的天然蛋白质分子量标准可反映水动力学尺寸与寡聚状态；变性（常伴还原）的SDS-PAGE条件下则采用SDS-PAGE蛋白质分子量标准，依据迁移率与分子量对数的线性关系进行表观分子量标定。

一、天然蛋白质标准

天然蛋白质分子量标准常选用鸡溶菌酶、鸡卵清白蛋白与牛血清白蛋白等代表性蛋白，亦包含由多亚基构成的寡聚体，用于在分子筛层析（SEC）与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（原生PAGE）条件下表征分子的水动力学尺寸与寡聚状态并进行分子量标定。

凝胶过滤用分子量标准品

二、SDS-PAGE蛋白质分子量标准

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）依据蛋白质的电荷、构象与尺寸进行分离；在加入十二烷基硫酸钠（SDS）后，蛋白质与SDS达到饱和结合（质量比约1:1.4，平均每1.87个氨基酸残基结合1个SDS分子），可基本屏蔽本征电荷并将多肽链拉直为近似棒状，从而使迁移行为主要取决于肽链长度。由此，可借助蛋白质分子量标准通过迁移率—对数分子量关系推算样品的表观分子量。SDS-PAGE分子量标准通常由单肽链蛋白组成，按用途分为非预染标准、预染标准、Western Blot专用标准以及荧光标记标准等类型，以满足电泳显带、转膜校准与多通道检测的不同需求。

1.SDS非预染蛋白质分子量标准

由于蛋白质/多肽链的氨基酸组成与序列差异会导致与SDS的结合量不同，即便理论分子量相同，其在SDS-PAGE中的表观分子量亦常与理论值偏离，且在不同缓冲体系下，因侧链性质与序列差异，不同标准蛋白的迁移率亦可能发生变化。为提高标定的可重复性与通用性，实践中常选用若干特性明确、应用广泛的天然蛋白组合配制为非预染蛋白质分子量标准，以在变性电泳条件下提供更稳定、可比的参照。

常用SDS-PAGE蛋白分子量标准的天然蛋白质

2.SDS预染蛋白质分子量标准

非预染蛋白质分子量标准需经凝胶染色方可显带，且天然蛋白标准常需煮沸并在还原条件下处理，操作相对繁琐；因此发展出预染蛋白质分子量标准：在多肽侧链上共价接入染料基团，使条带在电泳过程中实时可见，便于监控分离进程与电泳质量，并可直观估计条带大小及评估转膜效率，因而被广泛采用。需注意的是，染料的引入会改变蛋白/多肽的电荷—质量比与水动力学性质，导致其在不同缓冲体系下表现出与原蛋白不一致的表观分子量；故在更换缓冲体系或进行定量判读时，应使用非预染标准品在同一体系中对预染标准进行校准与换算，以保证分子量标定的准确性与可比性。

三、SDS Western Blot蛋白质分子量标准

Western Blot蛋白质分子量标准是在常规标准基础上，对多肽链进行标记，使其可在膜上直接显带以完成分子量定标与转膜质控。常见形式包括：预染+免疫可检型（可被通用二抗或链霉亲和素体系识别）、生物素化型、以及预偶联酶/荧光染料的直显型（含单/多色版本）。其优势是与样品同跑、同转膜、同显色，便于校准泳道、设置曝光并快速定位分子量。

四、SDS 荧光标记蛋白质分子量标准

荧光标记蛋白质分子量标准：在标准蛋白/多肽侧链共价接入荧光基团，使其在电泳与转膜后可通过特定激发/发射波长直接成像，用于条带定位与分子量标定。优点是灵敏度高、背景低、多通道/多色并行（可与样品不同荧光通道分离显示），便于定准泳道与评估转膜效率。

五、根据电泳图谱计算表观分子量

(1)确定测量基线，不连续胶从分离胶界面开始计算，梯度胶从加样孔底部开始计算。

(2)测量电泳条带的溶剂前沿相对于基线的距离，测量电泳条带的上沿相对于基线的距离，计算相对迁移率。

(3)以标准条带的相对迁移率（Rf＝条带迁移距离/溶剂前沿距离）为横轴，log₁₀(MW)为纵轴，作图并进行线性拟合；在目标蛋白所处的分子量区间内应呈良好线性（R²接近1）。若使用梯度胶或覆盖范围较宽，可在相邻区段分别做分段线性拟合。

(4)将样品条带的Rf代入该线性方程（或分段方程），由拟合曲线读取或计算其表观分子量（MW）。

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