蛋白质Tris-Acetate电泳系统标准操作规程
蛋白质Tris-Acetate电泳系统标准操作规程
1.实验器材
Ø垂直电泳系统：电源、电泳槽及配套附件
Ø制胶组件：厚板（spacer plate，0.75/1.0/1.5 mm）、薄板（short plate）与塑料框架
Ø移液工具：微量移液器及配套吸头（1 mL、200 μL、10 μL）
Ø采样与储存耗材：离心管（1.5 mL、15 mL、50 mL）
Ø玻璃器皿：烧杯、容量瓶（100 mL）、量筒（100 mL、500 mL、1 000 mL）、玻璃棒
Ø试剂容器：广口试剂瓶（500 mL、1 000 mL）、棕色瓶（250 mL、500 mL）
Ø实验耗材：滤纸、无尘擦拭纸、保鲜膜/密封袋
Ø计量与监测：pH计等
2.实验试剂
Ø40%丙烯酰胺：N,N’-亚甲基双丙烯酰胺37.5：1混合液（40%Acr-Bis）
组分 | 用量 |
Acrylamide（MW：71.08） | 38.96 |
Bisacrylamide（MW：154.17） | 1.04 |
配置方法：（100 mL）
①于100 mL烧杯称取丙烯酰胺（Acr）38.96 g与N,N′-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）1.04 g。
②加入蒸馏水50 mL（温水更利于溶解），磁力搅拌至完全溶解。
③转入100 mL容量瓶，以蒸馏水定容至100.0 mL，轻摇混匀。
注意：
①储存与稳定性：丙烯酰胺在光照与碱性条件下可缓慢脱氨生成丙烯酸/双丙烯酸。配制后核实溶液 pH ≤ 7.0，于 4 ℃ 避光保存；建议保存期 ≤ 2 个月。若出现不溶物（试剂杂质或贮存致析出），滤纸过滤后再分装储存。
②聚合与成胶机理：丙烯酰胺单体在自由基引发下聚合为长链，存在 N,N′-亚甲基双丙烯酰胺（Bis） 时发生交联形成三维凝胶网络；凝胶孔径由链长与交联度共同决定，进而影响分离范围与分辨率。
Ø3 mol/L Tris–Acetate缓冲液（pH 7.0）
配置方法（100 mL）：
①称取36.34 g Tris于100 mL烧杯；
②加入蒸馏水80 mL，磁力搅拌至完全溶解；
③以冰醋酸逐滴调至pH 7.0（实时监测pH）；
④转入100 mL容量瓶，以蒸馏水定容至100.0 mL；4 ℃贮存。
Ø10%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液
Ø10%过硫酸铵（APS）溶液
配制方法（10 mL）：
①称取过硫酸铵（APS）1.00 g于15 mL离心管；
②加入双蒸水至约8–9 mL，振荡溶解后定容至10.0 mL；
③按1.0 mL/管分装于1.5 mL离心管，避光，-20 ℃冻存。
注意：
①固体过硫酸铵（APS）易吸湿潮解并失活，建议采购小包装或购后立即分装；密封置于干燥处保存，或 –20 ℃ 冻存并配干燥剂、避光。
②小包装开启后一次性配制母液，随后按 1.0 mL/管分装于 1.5 mL 离心管，–20 ℃ 冻存；取用时单管解冻即用，避免反复冻融与回灌。
③贮存与操作要点：容器保持干燥洁净，尽量缩短开启暴露时间；避免金属离子污染与高温、强光。母液建议小批量现配，长期存放前可经滤膜除微粒。
④质量监控：若出现结块、变色或配制后起始反应迟缓，视为活性下降，弃用重配。
Ø四甲基乙二胺（TEMED）
Ø电泳缓冲液：（10×Tris Acetate SDS Running Buffer，10×TAS）
组分 | 用量 | 1×终浓度 |
Tris（MW：121.14） | 60.57 g | 50 mM |
乙酸钠（MW：82.03） | 41.02 g | 50 mM |
SDS（MW：288.38） | 10 g | 0.1% |
亚硫酸氢钠（MW：104.1） | 2.5 g | 2.4 mM |
定容至1000 ml | ||
pH=8.24
配制方法（1000 mL）：
①称取Tris 60.57 g、乙酸钠（无水）41.02 g、SDS 10.00 g、亚硫酸氢钠2.50 g于1 000 mL烧杯。
②加入蒸馏水800 mL，磁力搅拌至完全溶解。
③转入1 000 mL试剂瓶（或先经量筒定容后回灌），以蒸馏水定容至1 000.0 mL；母液室温密封保存，建议使用期1个月。
④使用时按需取用，以蒸馏水10倍稀释至工作浓度（1×）。pH应在8.24附近；若偏差>0.5，需调整pH，并优先核查用水pH、试剂纯度与贮存条件等因素。
Ø转印缓冲液（10×Tris Acetate Transferring Buffer）
组分 | 用量 | 1×终浓度 |
Tris（MW 121.14） | 30.29 g | 25 mM |
乙酸钠（无水，MW 82.03） | 20.51 g | 25 mM |
20 mL | 1 mM | |
亚硫酸氢钠（MW：104.1） | 1.35 g | 1.3 mM |
定容至1000 mL | ||
pH 7.2
配制方法（1000mL）：
①称取Tris 30.29 g，乙酸钠20.51 g，亚硫酸氢钠1.35 g加入1000 mL烧杯中；
②加0.5M EDTA 20 mL,800 mL蒸馏水，搅拌使其充分溶解；
③倒入1000 mL试剂瓶中，用蒸馏水定容至1000 mL刻度线，母液室温4℃保存可一个月；
④使用时按需求量倒取，添加20%体积甲醇，加蒸馏水稀释至工作浓度（1×）。
Ø分离胶及浓缩胶配方表
Separation Gel（T=7%）
组件 | 5 mL | 8 mL | 10 mL | 16 mL | 20 mL | 25 mL |
ddH₂O (mL) | 3.76 | 6.01 | 7.52 | 12.02 | 15.03 | 18.79 |
40% Acr–Bis (mL) | 0.88 | 1.40 | 1.75 | 2.80 | 3.50 | 4.38 |
3 M Tris–Acetate pH 7.0 (mL) | 0.34 | 0.54 | 0.68 | 1.08 | 1.35 | 1.69 |
10% APS (µL) | 24 | 38 | 48 | 77 | 96 | 120 |
TEMED (µL) | 6 | 10 | 12 | 19 | 24 | 30 |
Separation Gel（T=6%）
组件 | 5 mL | 8 mL | 10 mL | 16 mL | 20 mL | 25 mL |
ddH₂O (mL) | 3.91 | 6.26 | 7.82 | 12.52 | 15.65 | 19.56 |
40% Acr–Bis (mL) | 0.75 | 1.20 | 1.50 | 2.40 | 3.00 | 3.75 |
3 M Tris–Acetate pH 7.0 (mL) | 0.34 | 0.54 | 0.68 | 1.08 | 1.35 | 1.69 |
10% APS (µL) | 24 | 38 | 48 | 77 | 96 | 120 |
TEMED (µL) | 6 | 10 | 12 | 19 | 24 | 30 |
Separation Gel（T=5%）
组件 | 5 mL | 8 mL | 10 mL | 16 mL | 20 mL | 25 mL |
ddH₂O (mL) | 4.04 | 6.46 | 8.07 | 13.00 | 16.15 | 20.19 |
40% Acr–Bis (mL) | 0.62 | 1.00 | 1.25 | 2.00 | 2.50 | 3.12 |
3 M Tris–Acetate pH 7.0 (mL) | 0.34 | 0.54 | 0.68 | 1.08 | 1.35 | 1.69 |
10% APS (µL) | 24 | 38 | 48 | 77 | 96 | 120 |
TEMED (µL) | 6 | 10 | 12 | 19 | 24 | 30 |
Separation Gel（T=4%）
组件 | 5 mL | 8 mL | 10 mL | 16 mL | 20 mL | 25 mL |
ddH₂O (mL) | 4.16 | 6.66 | 8.32 | 13.32 | 16.65 | 20.81 |
40% Acr–Bis (mL) | 0.50 | 0.80 | 1.00 | 1.60 | 2.00 | 2.50 |
3 M Tris–Acetate pH 7.0 (mL) | 0.34 | 0.54 | 0.68 | 1.08 | 1.35 | 1.69 |
10% APS (µL) | 24 | 38 | 48 | 77 | 96 | 120 |
TEMED (µL) | 6 | 10 | 12 | 19 | 24 | 30 |
Loading Gel（3%）
组件 | 1 mL | 2 mL | 3 mL | 4 mL | 5 mL | 6 mL |
ddH₂O (mL) | 0.85 | 1.70 | 2.55 | 3.41 | 4.26 | 5.11 |
40% Acr–Bis (mL) | 0.08 | 0.15 | 0.23 | 0.30 | 0.38 | 0.45 |
3 M Tris–Acetate pH 7.0 (mL) | 0.07 | 0.14 | 0.20 | 0.27 | 0.34 | 0.41 |
10% APS (µL) | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
TEMED (µL) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
注：总体积为主组分体积，不含APS/TEMED；使用时另行加入表中APS/TEMED。
Ø中性上样缓冲液（LDS样品缓冲液4×）
组分 | 用量（配制10 mL 4×） | 4×终浓度 |
Tris（MW 121.14） | 1.21 g | 1 M |
LDS（十二烷基醚硫酸锂） | 0.80 g | 8%（m/v） |
EDTA-2Na-2H₂O（MW 372.24） | 3.72 mg | 1 mM |
4.0–5.0 mL | 40–50%（v/v） | |
7.5 mg | 0.075%（m/v） | |
2.5 mg | 0.025%（m/v） | |
定容至10.0 mL | ||
pH 8.5
配制方法（10mL）：
①称取Tris 1.21 g，LDS 0.8 g，考马斯亮蓝7.5 mg,苯酚红2.5 mg,加入10 mL离心管中；
③用蒸馏水定容至10 mL刻度线，母液室温4℃保存可一个月；
④使用时按需求量取用，若蛋白样品中没有添加DTT，可在1X工作液中添加终浓度100 mM DTT。
Ø无水乙醇
Ø水系统：蒸馏水（dH₂O）或反渗透水（RO），双蒸水（ddH₂O）及超纯水（UP）
3.聚丙烯酰胺凝胶的配制
（1）凝胶模具准备
①按实验需求选择相应厚度的电泳玻璃板（与间隔片规格匹配）。
②以75%（v/v）乙醇擦拭脱脂，复以蒸馏水冲洗；用无尘擦拭纸拭干并去除微粒。
③依说明书装配并固定于灌胶器，确认密封良好、夹持均匀。
（2）分离胶灌制
①按顺序于容器中加入：蒸馏水、40% Acr–Bis、3 mol/L Tris–Acetate（pH 7.0），轻柔混匀至均一。
③以移液器沿玻璃板内侧缓慢灌注分离胶：液面至前板顶端下约1.5 cm，或距梳齿约0.5 cm即止。
④于表面覆盖约1 cm蒸馏水，使液面平整并隔绝空气。
⑤室温静置20–40 min；待分离胶与上层水形成清晰界面即视为聚合完成。弃去上层水，倾斜玻板以滤纸吸尽残留水分。
（3）浓缩胶灌制
①于容器中依次加入：蒸馏水、40% Acr–Bis、3 mol/L Tris–Acetate（pH 7.0），充分混匀。
③沿玻璃板壁缓慢灌注至接近玻板顶端；垂直插入梳子形成上样孔，静置聚合10–20 min。
④凝固后，将凝胶连同玻板装入电泳槽；加入电泳缓冲液后小心拔除梳子，即可准备上样电泳。若需暂存，可连板置于自封袋密封，4℃保存（袋内可加入少量蒸馏水以维持湿度）。
（4）操作提示
①配制 mini 胶时，可选用 15 mL/50 mL 离心管作容器，通过旋转摇匀或移液器反复吹打混匀。
②大体积配制建议使用匹配容量的烧杯，以玻璃棒充分搅拌。
③无论何种方式，全程尽量避免气泡产生；若出现微泡，沿壁缓慢上升排出后再灌胶。
4.蛋白电泳
（1）样品准备
①预热水浴锅或干式金属浴至70–100℃。
②将所需量蛋白样品转移至1.5 mL微量离心管，按顺序编号并记录。
③按规定比例加入上样缓冲液（可根据实验需求选择还原或非还原的中性配方），轻混均一。
④将样品置于水浴/金属浴加热10–15 min。
⑤取出后冷却至室温，瞬时离心10–30 s收集液体。
⑥按编号整理，备用上样。
（2）电泳
①将凝胶以上样孔朝上装入电泳槽；分别向内、外槽加入电泳缓冲液：外槽液面需覆盖电极/铂丝，内槽加至完全淹没上样孔。
②垂直、缓慢拔出梳子；上样前以移液器吸取少量缓冲液对各上样孔轻吸排，去除残胶与气泡。
③采用微量移液器按既定顺序加样并记录。
④设定130 V（I≈115 mA）运行，约1 h 15 min；当示踪染料前沿到达胶底部时停止。可依据目标蛋白分子量与分离效果适当缩短或延长电泳时间。
（3）操作提示
①优先使用凝胶上样专用吸头，确保样品完整注入上样孔。
②控制上样体积，避免过载与溢入相邻孔，以防条带干扰。
③吸头插入深度勿触及孔底，以免造成条带扭曲；亦不宜过高，避免样品在缓冲液中弥散。
④连续完成加样，缩短样品在孔内滞留时间，降低弥散风险。
参考文献
1.Methods in molecular biology, 869, 205–213.
2.Cubillos-Rojas M, et al. Tris-acetate polyacrylamide gradient gels for the simultaneous electrophoretic analysis of proteins of very high and low molecular mass. Methods in molecular biology, 869, 205–213. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-821-4_17
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