1 概述

1.1 目的与适用范围

        本规程用于建立原代成骨细胞在β-磷酸三钙（β-TCP）圆片上的矿化诱导及茜素红S（Alizarin Red S，ARS）染色定量检测流程，适用于骨替代材料、生物陶瓷支架及相关成骨诱导体系中矿化能力的体外评价。

1.2 方法原理

（1）原代成骨细胞在含抗坏血酸和β-甘油磷酸酯的矿化培养体系中培养后，可逐步形成钙盐沉积。

（2）ARS可与矿化结节中的钙盐结合形成橙红色复合物，用于矿化结节的形态学观察。

（3）染色后的ARS可采用十六烷基吡啶氯化铵溶液提取，并通过520 nm吸光度定量分析，从而评价不同培养条件或材料表面的矿化水平。

1.3 实验设计特点

（1）生物材料样品采用悬浮培养板培养，以避免细胞黏附于塑料底部。

（2）标准组织培养板作为对照，用于评估常规贴壁条件下的矿化能力。

（3）实验终点包括矿化结节成像记录和ARS提取液定量检测两部分。

2 材料与试剂

2.1 细胞与材料

（1）原代小鼠成骨细胞（OB）。

（2）直径14 mm的β-TCP圆片。

2.2 主要培养液与试剂

（1）基础培养液，用于成骨细胞贴附、生长和预培养。

（2）矿化培养液：基础培养液+抗坏血酸50 μg/mL + β-甘油磷酸酯5 mM。

（3）1× PBS。

（4）10%缓冲福尔马林固定液。

（5）ARS染色液：40 mM，溶于超纯水，pH 4.2。

（6）10%十六烷基吡啶氯化铵溶液。

（7）超纯水。

2.3 耗材与器材

（1）24孔悬浮培养板。

（2）24孔组织培养板。

（3）96孔板。

（4）1.5 mL离心管。

（5）移液器及吸头。

（6）平板扫描仪。

（7）酶标仪。

（8）CO2培养箱。

（9）振荡器。

（10）高速离心机。

3 实验准备

3.1 β-TCP圆片预孵育

（1）将直径14 mm的β-TCP圆片置于24孔悬浮培养板中。

（2）每孔加入1 mL基础培养液。

（3）于37 ℃、5% CO2条件下预孵育24 h。

（4）本步骤用于使材料充分润湿并稳定培养环境。

3.2 对照设置

（1）材料组使用24孔悬浮培养板，以避免细胞附着于塑料底部。

（2）对照组使用标准24孔组织培养板。

（3）对照组和材料组应采用相同细胞接种密度、相同培养液体积和相同培养周期。

3.3 细胞准备

（1）原代小鼠成骨细胞以基础培养液重悬。

（2）接种前应确认细胞活率和分散状态良好。

（3）接种浓度按8.8 × 10^4 cells/cm²计算。

4 成骨细胞矿化诱导

4.1 细胞接种

（1）吸去β-TCP圆片预孵育培养液。

（2）将原代小鼠成骨细胞以基础培养液重悬后，接种于预孵育的β-TCP圆片表面。

（3）材料组使用24孔悬浮培养板，每孔总体积1 mL。

（4）对照组将相同密度细胞接种于24孔组织培养板中，每孔1 mL。

（5）接种后于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h，使细胞贴附于材料表面或培养板表面。

4.2 矿化诱导培养

（1）接种24 h后，吸去基础培养液。

（2）每孔加入1 mL新鲜配制的矿化培养液。

（3）于37 ℃、5% CO2条件下继续培养14 d。

（4）每2～3 d更换1次培养液，每次加入1 mL新鲜配制矿化培养液。

（5）培养期间应避免剧烈吹打，以减少材料表面细胞脱落。

5 茜素红S染色

5.1 终止培养与洗涤

（1）加入矿化培养液培养14 d后，吸去培养液。

（2）每孔加入0.5 mL 1× PBS，于室温下轻柔洗涤2次。

（3）吸尽PBS，避免残留液体影响后续固定。

5.2 固定

（1）每孔加入0.5 mL 10%缓冲福尔马林。

（2）室温固定10 min。

（3）吸去固定液后，以0.5 mL超纯水洗涤2次。

5.3 ARS染色

（1）每孔加入0.25 mL 40 mM ARS染色液（pH 4.2）。

（2）将培养板置于振荡器上，于室温下以100 rpm振荡染色10 min。

（3）吸去染色液。

（4）每孔加入1 mL超纯水冲洗，重复5～10次，直至漂洗液无色。

（5）冲洗后加入1 mL冷PBS，于室温下100 rpm振荡10 min。

（6）吸去PBS。

5.4 成像记录

（1）将染色后的β-TCP圆片转移至新孔中。

（2）使用平板扫描仪采集图像，记录矿化结节分布和染色强度。

6 ARS提取与定量

6.1 染料提取

（1）每孔加入0.25 mL 10%十六烷基吡啶氯化铵溶液。

（2）室温下于振荡器上以100 rpm振荡15 min，以提取结合于矿化结节中的ARS。

（3）收集上清液至1.5 mL离心管中。

（4）室温下以17000 × g离心5 min。

6.2 样品处理

（1）取离心后的上清液作为检测样品。

（2）以10%十六烷基吡啶氯化铵溶液按1:10～1:20稀释样品。

（3）每份样品取300 μL加入96孔板中。

（4）同时设置2个仅含10%十六烷基吡啶氯化铵溶液的空白孔。

6.3 标准曲线制备

（1）以40 mM ARS染色液（pH 4.2）为母液。

（2）用10%十六烷基吡啶氯化铵溶液配制7个浓度梯度的ARS参比标准品，范围为4～400 μM。

（3）每个标准品取300 μL加入96孔板，做复孔检测。

6.4 吸光度检测

（1）于520 nm读取样品、空白孔及参比标准品的吸光度。

（2）从标准品和样品读数中扣除空白值。

（3）根据标准曲线换算样品中ARS含量，用于反映矿化水平。

7 结果判读要点

7.1 形态学观察

（1）ARS染色后，矿化区域呈橙红色至红色。

（2）矿化结节越多、染色越强，提示矿化水平越高。

（3）材料表面与对照组的矿化结节分布应结合成像结果综合比较。

7.2 定量分析

（1）ARS提取液在520 nm的吸光度越高，通常提示矿化沉积越多。

（2）应结合标准曲线进行定量换算，而非直接比较原始吸光度。

（3）建议以每孔总量、单位面积或单位细胞数进行归一化分析。

8 关键控制点

8.1 材料预处理

（1）β-TCP圆片应充分预孵育，以保证润湿一致性。

（2）不同批次材料应记录规格、孔径和表面状态。

8.2 细胞接种

（1）接种密度应保持一致。

（2）材料组必须使用悬浮培养板，避免细胞附着到塑料底部。

8.3 矿化诱导

（1）矿化培养液必须新鲜配制。

（2）培养液更换周期应保持一致，避免矿化刺激不足或波动过大。

8.4 ARS染色

（1）染色液pH应控制在4.2。

（2）冲洗必须充分，直至漂洗液无色，否则会导致非特异性背景偏高。

8.5 定量检测

（1）样品稀释倍数应保持在线性范围内。

（2）标准曲线应与样品使用同一提取体系。

9 常见问题与原因分析

9.1 矿化结节染色弱

（1）矿化培养时间不足。

（2）抗坏血酸或β-甘油磷酸酯失效或浓度不足。

（3）原代成骨细胞活性下降或分化能力不足。

9.2 背景高或非特异性染色明显

（1）ARS染色后冲洗不充分。

（2）染色液pH不准确。

（3）样品表面残留大量未结合染料。

9.3 提取液吸光度波动大

（1）β-TCP圆片之间细胞接种不均。

（2）样品转移和提取时间控制不一致。

（3）样品稀释倍数不合适或超出检测线性范围。

9.4 材料组与对照组不可比

（1）培养板类型使用不一致。

（2）材料尺寸、表面积或细胞接种面积未统一。

（3）材料表面细胞附着效率差异未加控制。

10 质量控制

10.1 细胞质量控制

（1）记录原代细胞来源、代次、活率及接种密度。

（2）同批实验尽量使用同来源、同批次细胞。

10.2 材料质量控制

（1）记录β-TCP圆片尺寸、批号和预处理条件。

（2）不同批次材料不宜直接混合比较。

10.3 检测质量控制

（1）每批实验应同时设置空白孔、对照组和标准曲线。

（2）样品检测和标准曲线应至少设置复孔。

11 安全与操作规范

11.1 个人防护

（1）实验过程中应穿实验服并佩戴一次性手套。

（2）处理福尔马林和十六烷基吡啶氯化铵时应在规范条件下操作。

11.2 废弃物处理

（1）含福尔马林、ARS染液及十六烷基吡啶氯化铵的废液应分类收集。

（2）所有污染耗材和废液应按实验室生物及化学废弃物处理规范处置。

12 相关试剂与材料选型

表1 β-TCP支架上成骨细胞矿化及茜素红S定量检测相关试剂选型

更多相关文章，详见下方：

[1] 茜素红S染色与Von Kossa银染的矿化显示方法学要点