1 概述

1.1 目的与适用范围

        本规程用于测定细胞或微生物提取液中磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucose isomerase，PGI)活性，适用于发酵液菌体、细胞裂解上清及其他可溶性蛋白样品的酶活检测。

1.2 方法原理

        PGI催化6-磷酸果糖(F6P)与6-磷酸葡萄糖(G6P)之间的可逆异构化反应。在偶联体系中，PGI先将F6P转化为G6P；随后在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)作用下，G6P与NADP⁺反应生成NADPH。NADPH在340nm处具有特征吸收峰，因此可通过340nm吸光度随时间的增加速率计算PGI酶活。

2 材料与试剂

2.1 样本

（1）发酵液离心得到的菌体沉淀。

（2）细胞裂解上清。

（3）其他可溶性酶提取液。

2.2 主要试剂

（1）100mM磷酸缓冲液(pH 7.0)。

（2）100mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)。

（3）NADP⁺。

（4）MgCl₂。

（5）6-磷酸果糖(F6P)。

（6）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)。

（7）石英砂，可选，用于机械辅助破壁。

（8）去离子水或超纯水。

2.3 仪器

（1）离心机。

（2）超声波破碎仪。

（3）紫外-可见分光光度计或具有340nm动力学检测功能的酶标仪。

（4）恒温水浴或恒温模块。

（5）1cm光程石英比色皿。

3 样本制备

3.1 细胞收集

（1）取25mL发酵液或细胞悬液。

（2）于适当转速离心，弃上清，收集细胞沉淀。

3.2 细胞洗涤

（1）加入100mM、pH 7.0的磷酸缓冲液重悬沉淀。

（2）离心后弃上清。

（3）重复洗涤2次。

（4）最后将细胞沉淀重悬于5mL磷酸缓冲液中。

3.3 细胞破壁

（1）将细胞悬液置于冰浴条件下。

（2）采用超声波破碎10min，参考条件为40kHz、10s工作、5s间歇。

（3）若样品较难破碎，可加入适量石英砂辅助破壁。

（4）破碎结束后离心，收集上清，作为粗酶液备用。

4 酶活测定

4.1 反应体系配制

        1mL总反应体系如下：

（1）100mM Tris-HCl(pH 7.8)。

（2）10mM MgCl₂。

（3）0.5mM NADP⁺。

（4）2mM F6P。

（5）1U G6PDH。

（6）适量去离子水补足体积。

（7）最后加入100μL样品启动反应。

4.2 空白对照

        建议至少设置以下对照：

（1）样品空白：以缓冲液代替F6P，用于校正样品本底吸收变化。

（2）试剂空白：以缓冲液代替样品，用于排除试剂体系自发反应。

（3）必要时可设置失活样品对照。

4.3 反应条件

（1）检测温度可固定为25℃；若采用37℃检测，应全文保持一致并统一计算条件。

（2）将除样品外的反应液预平衡3～5min。

（3）加入样品后迅速混匀并立即开始检测。

5 吸光度检测

5.1 检测条件

（1）检测波长：340nm。

（2）光程：1cm。

（3）记录时间：建议连续监测3～5min。

（4）采样间隔：每30s记录1次吸光度，或采用仪器连续动力学采集模式。

5.2 结果读取

（1）选取反应初始线性阶段数据。

（2）计算ΔA340/min。

（3）扣除空白后用于酶活计算。

6 酶活计算

6.1 计算参数

        NADPH在340 nm处的摩尔吸光系数可按以下形式用于计算：

        ε340 = 6.22 mM⁻¹·cm⁻¹

6.2 计算公式

        酶活(U/mL) = (ΔA340/min × Vt)/(6.22 × l × Vs)

        其中：

        Vt为反应总体积(mL)

        ε：NADPH在340nm处的摩尔吸光系数

        l为光程长度(cm)

        Vs为加入样品体积(mL)

6.3 酶活定义

        一个酶活单位(U)定义为在规定条件下，每分钟催化生成1 μmol NADPH所对应的酶量。

7 结果判读要点

7.1 线性区判断

（1）吸光度应在反应初始阶段呈线性上升。

（2）若曲线前段波动明显，应检查混匀、温控及样品澄清度。

（3）若整体上升过快并超出线性范围，应适当稀释样品后重测。

7.2 空白控制

（1）空白对照不应出现明显持续升高。

（2）若空白吸光度明显增加，提示试剂污染、底物降解或体系中存在其他干扰酶。

8 关键控制点

8.1 样品处理

（1）细胞破碎过程应尽量在低温条件下进行。

（2）粗酶液制备后应尽快检测，避免反复冻融。

（3）样品若含大量颗粒，应充分离心，避免影响340nm读数。

8.2 反应体系

（1）NADP⁺与G6PDH应配套使用。

（2）F6P浓度不宜过低，以免限制反应速率。

（3）MgCl₂有助于偶联酶体系稳定，建议保留。

8.3 检测条件一致性

（1）温度、光程、总体积和样品加入体积应保持一致。

（2）若改用酶标仪，应注意有效光程修正。

9 常见问题与原因分析

9.1 吸光度不上升

（1）样品中PGI活性过低。

（2）G6PDH失活。

（3）NADP⁺或F6P漏加。

（4）样品破壁不充分。

9.2 空白值偏高

（1）试剂体系污染。

（2）样品中存在其他可引起NADPH生成的酶。

（3）底物或辅酶配制不新鲜。

9.3 重复性差

（1）超声破碎条件不稳定。

（2）样品混匀不足。

（3）加样时间差过大。

（4）温度控制不一致。

10 安全与操作规范

10.1 个人防护

（1）实验过程中应穿实验服并佩戴一次性手套。

（2）超声破碎时应注意防护并避免样品过热。

10.2 废液处理

（1）含酶、辅酶及底物的反应废液应分类收集。

（2）样品废液及污染耗材应按实验室生物化学废弃物规范处理。

11 相关试剂与材料选型

表1 PGI酶活测定相关试剂与材料选型