在提取过程的第一阶段细胞的 RNA 酶应尽快灭活。一旦内源的 RNA 酶被破坏，RNA 受损的可能就大大降低，而纯化的过程就可以按合适的速度进行。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

操作方法

用酸性酚-硫氰酸胍-氯仿提取法纯化组织和细胞中的RNA

原理

在提取过程的第一阶段细胞的 RNA 酶应尽快灭活。一旦内源的 RNA 酶被破坏，RNA 受损的可能就大大降低，而纯化的过程就可以按合适的速度进行。

材料与仪器

细胞和组织
氯仿 乙醇 异丙醇 液氮 苯酚 磷酸缓冲盐溶液 PBS 乙酸钠 溶液 D（变性液）
比色杯 组织匀浆器 研棒和研钵 聚丙烯管 水浴

步骤

一、材料

1. 溶液与缓冲液

氯仿：异戊醇（49:1，V/V）

乙醇

异丙醇

液氮

苯酚

磷酸缓冲盐溶液 PBS（仅供悬浮细胞和单层细胞用）

乙酸钠（2 mol/L，pH 4.0）

溶液 D（变性液）

去离子甲酰胺（可选）

细胞和组织

2. 离心与转子

Sorvall SS-34 (或与之相当的转子）；Sorvall H1000 (或与之相当的转子）

3. 专用设备

测 260 nm 吸光率的比色杯

组织匀浆器

用 DEPC 水处理过、预冷的研棒和研钵

聚丙烯管

65℃ 水浴

二、方法

1. 选取从组织或细胞中提取 RNA 的适宜方法

(1) 组织

① 分离组织并立即置于液氮中。

② 将约 100 mg 冰冻组织含液氮的研钵中，用研棒研磨。研磨过程中可加入液氮使组织保持冰冻状态。

③ 将组织碎末移入含 3 ml 溶液 D 的管中。

④ 用搅拌子室温下搅拌组织 15~30 s。

(2) 哺乳动物悬浮细胞

① 室温下 200~1900 g 离心 5~10 min (1000~3000 r/min 用 Sorvall RT600, H1000 转子）收获细胞。

② 吸出培养基将细胞重悬于 1~2 ml 冰预冷的 PBS 中。

③ 离心收获细胞，彻底吸尽 PBS, 每 10⁶ 细胞加 2 ml 溶液 D。

④ 用搅拌子室温下搅拌细胞 15~30 s。

(3) 哺乳动物单层培养细胞

① 吸出培养基用 5~10 ml 冰冷的 PBS 洗细胞一次。

② 吸出 PBS 加入溶液 D 覆盖细胞，90 mm 培养皿加 2 ml ( 60 mm 培养皿加 1 ml)。

③ 将细胞溶解物移至管中。

④ 用搅拌子室温下搅拌溶解细胞 15~30 s。

2. 将混合物移至一管中，在每毫升溶液 D 中立即加入 0.1 ml 2 mol/L 的醋酸钠 ( pH 4.0),1 ml 酚，0.2 ml 氯仿-异戊醇。加入每种组分后，盖上管盖，倒置混匀。

3. 将匀浆剧烈振荡 10 s。冰浴 15 min 使核蛋白质复合体彻底裂解。

4. 10000 g ( 9000 r/min 用 Sorvall SS-34 转子）4℃ 离心 20 min, 将上层含 RNA 的水相移入一新管中。

5. 加入与提取的 RNA 等量的异丙醇。充分混合液体，并在 -20℃ 沉淀 RNA 1 h 或更长时间。

6. 10000 g ( 9000 r/min 用 Sorvall SS-34 转子）4℃ 离心 30 min, 收集沉淀的 RNA。

7. 轻轻倒出异丙醇加入溶液 D 溶解 RNA 颗粒，每 1 ml 第一步所使用的溶液加 0.3 ml 溶液 D。

8. 将溶液移至一微量离心管，涡旋混匀，并在 -20℃ 用等量异丙醇沉淀 RNA 1 h 或更长时间。

9. 在微量离心机上，于 4℃ 最大速离心 10 min 收集 RNA 沉淀。用 75% 的乙醇洗涤沉淀 2 次，重复离心。用一次性使用的吸头吸出残存的乙醇。将打开盖的离心管在实验台放置几分钟，以便乙醇蒸发。RNA 不可完全干燥。

10. 加 50~100 μl DEPC 处理过的水。将 RNA 溶液贮存于 -70℃。

11. 估计 RNA 的浓度。

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