焦磷酸测序 (pyrosequencing) 是一种基于发光法测定焦磷酸 (PPi) 的测序技术。焦磷酸测序技术的三个关键点分别是：①反应中使用 dATP 的类似物 dATPaS，因为 dATP 的结构与 ATP 相似，能与荧光素反应发出荧光，而 dATPαS 几乎不产生背景荧光。②反应中三磷酸腺苷双磷酸酶使测序能循环进行，因为每加一种 dNTP 时必须除去上一次未反应的 dNTP，否则会影响连续测序。这种双磷酸酶能够在聚合反应完成后降解剩余的 dNTP，因此无需用分离或洗涤步骤来除去剩余的 dNTP。③使测序信号形成峰。由于测序反应产生的 ATP 信号会使背景累积而溢出，从而使测序无法进行，然而，用于降解 dNTP 的三磷酸腺苷双磷酸酶同时也能降解 ATP，因此可以得到峰信号。

原理

焦磷酸测序 (pyrosequencing) 的基本原理是：

①一条特异性测序引物与单链模板 DNA 退火后，加入酶混合物和底物混合物，其中酶混合物中包括 DNA 聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶（ATP sulfurylase）、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）；底物混合物中包括 5＇-磷酸化硫酸腺苷（adenosine 5＇-sul-phatophosphate，APS）和荧光素。

②向反应体系中加入 1 种 dNTP，如果它和 DNA 模板的下一个碱基配对，则会在 DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的 3＇-末端，同时释放出一分子 PPi。

③在三磷酸腺苷硫酸化酶的作用下，生成的 PPi 与 APS 结合形成 ATP。在荧光素酶的催化下，ATP 与荧光素结合形成氧化荧光素，同时发光，最大波长约为 560nm，荧光信号强度（即检测峰值的高低）与聚合的 dNTP 个数呈正比。

④反应体系中剩余的 dNTP 和残留的 ATP 在三磷酸腺苷双磷酸酶的作用下发生降解。

⑤加入另一种 dNTP，重复第②～④步反应。通过这种循环反应，根据加入的 dNTP 类型和荧光信号强度（峰值的高低），就可实时读取模板 DNA 的准确核苷酸序列信息。

原理如图所示：

应用

焦磷酸测序技术操作简单，结果准确，可用于单核苷酸多态性位点分析、等位基因频率测定、细菌和病毒等微生物的分型鉴定、CpG 甲基化分析、扫描与疾病相关基因序列中的点突变等领域。

操作方法

焦磷酸测序

材料与仪器

试剂：
DNA 模板、dNTP、引物
仪器：
测序仪

步骤

焦磷酸测序技术的基本过程有以下几步：

2. 向反应体系中加入 1 种 dNTP , 如果它和 DNA 模板的下一个碱基配对，则会在 DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的 3'- 末端，同时释放出一分子 PPi。

3. 在三磷酸腺苷硫酸化酶的作用下，生成的 PPi 与 APS 结合形成 ATP。在荧光素酶的催化下，ATP 与荧光素结合形成氧化荧光素，同时发光，最大波长约为 560nm , 荧光信号强度（即检测峰值的高低）与聚合的 dNTP 个数呈正比。

4. 反应体系中剩余的 dNTP 和残留的 ATP 在三磷酸腺苷双磷酸酶的作用下发生降解。

5. 加入另一种 dNTP , 重复第②-④步反应。通过这种循环反应，根据加入的 dNTP 类型和荧光信号强度（峰值的高低），就可实时读取模板 DNA 的准确核苷酸序列信息。

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