定量甲基化特异性 PCR（quantitative methylation specific PCR, qMSP）是一种用于检测 DNA 甲基化程度的分子生物学方法，可测定 DNA 特定位点甲基化状态的百分比，适用于描述甲基化在基因表达中的作用以及疾病发生发展的分子生物学机制研究等领域。

原理

定量甲基化特异性 PCR 基于 PCR 技术，结合特异性限制性内切酶和荧光定量 PCR 技术，通过测定甲基化与未甲基化的 DNA 特定位点合成 PCR 产物的比例，来准确表征 DNA 甲基化程度。

应用

定量甲基化特异性 PCR 可用于检测和定量 DNA 甲基化在基因表达、基因组稳定性、癌症及其他疾病中的作用。

操作方法

定量甲基化特异性PCR（qMSP）

原理

定量甲基化特异性 PCR 基于 PCR 技术，结合特异性限制性内切酶和荧光定量 PCR 技术，通过测定甲基化与未甲基化的 DNA 特定位点合成 PCR 产物的比例，来准确表征 DNA 甲基化程度。

材料与仪器

① PCR 试剂盒：反应体系含有 dNTPs，Taq DNA 聚合酶、MgCl
2
和 PCR 反应缓冲液
② DNA 纯化试剂盒
③ 限制性内切酶：如 HhaI 等
④ 模板 DNA：被测 DNA 样品
⑤ 甲基化特异性引物：甲基化引物和非甲基化引物（两组）
⑥ Taqman 探针
⑦ DEPC 水：用于 PCR 梯度稀释，从而生成标准曲线
⑧ PCR 仪
⑨ 打印机和电脑

步骤

不同的厂家和不同型号的定量甲基化特异性 PCR 试剂盒操作步骤可能会有所不同，这里给出一般的操作步骤作为参考：

1. DNA 模板制备：

a. 提取待测样品 DNA 并消化 RNA。

b. 检测 DNA 纯度及浓度，保证 PCR 反应的准确性。

2. 甲基化状态检测：

a. 根据实验需要，选择合适的甲基化检测方法，包括甲基化特异性 PCR 或甲基化敏感性限制性内切酶（MS-RE）消化。

b. 根据需要，对待测样品进行甲基化处理或不甲基化处理。

3. PCR 反应体系配置：

a. 按照试剂盒说明书的指引，配置 PCR 反应体系。

b. 将 DNA 模板加入 PCR 管中。

4. PCR 反应条件：

a. PCR 参数根据试剂盒的要求进行设置。

b. PCR 反应结束后，可以通过跑胶来检测 PCR 产物的大小和数量。

5. 数据分析：

a. 进行 PCR 产物的分析，确定 DNA 片段的大小和甲基化状态。

b. 对数据进行统计学分析，得出甲基化程度。

注意事项

① 在处理 DNA 前所有操作须严格避免污染，以确保实验数据的可靠性。② 注意消耗品的保管，避免受到环境温度的影响。③ 在调制 PCR 反应体系时，按照试剂盒说明操作。如有改变，会影响 PCR 反应体系，导致最终数据不准确。④ 甲基化特异性 PCR 系统需要经过优化，因此，对样品纯化也需要注意。⑤ 在 PCR 反应中，需要分别使用甲基化引物和非甲基化引物两组来进行扩增，以比较它们生成的 PCR 产物，从而确定甲基化部位。⑥ 甲基化的位置以及嵌合位点的距离，会影响特异性引物的效果，应根据不同情况进行合理设计。⑦ 为确保结果的准确性，需要进行验证实验，针对不同 DNA 样本的甲基化状态、限制性酶切修饰等进行验证。

常见问题

① 为何样品为 PCR 反应体系添加分子标记？

答：分子标记用来检测和核实 PCR 反应产物和样品。

② 为何 PCR 反应后，能在 20-40 个循环周期内得到特定片段的扩增产物？

答：PCR 反应为无模板法扩增，反应产物指定长短，反应模式为指数级，反应周期与试剂盒中 PCR 体系具体情况有关。

③ 若 PCR 反应得到不明显增强带怎么办？

答：检查与优化产物的反应体系，可以增加两个浓度之差，增加反应温度，更换引物。

④ 扩增产物太少

答：样品质量不好，建议增加 DNA 模板的浓度。

⑤ 扩增产物过多

答：可能是由于模板 DNA 过多，实验需要逐步减少模板 DNA 的量。

⑥ 过少的 PCR 扩增产物

答：可能是由引物过期或者限制性酶切的问题，检查引物的质量以及限制性酶切反应体系的合理性。

实验方法参考文献：

1. Frommer M, McDonald LE, Millar DS 等人：「一种基因组测序方案，可在单个 DNA 链中产生 5-甲基胞嘧啶残基的阳性显示」。美国国家科学院院刊，1992，89：第 1827-1831 页。

2. Herman JG, Graff JR, et al. 「甲基化特异性 PCR：一种基于 PCR 的新型甲基化状态分析方法」。美国国家科学院院刊，1996，93：第 9821-9826 页。

3. Eads CA, Danenberg KD, Kawakami K, et al.  「'MethyLight'：一种用于测量 DNA 甲基化的高通量测定」。核酸研究， 2000, 28（8）：第 E32 页。

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