实验方案（Protocols）

RAGE 小鼠单克隆抗体实验方案：Western blot、免疫组化及免疫荧光应用

· · 发布于 2026年10月6日 · 更新于 2026年10月6日 ·

RAGE Mouse mAb是一种靶向晚期糖基化终末产物受体（RAGE）的小鼠单克隆抗体，已验证可用于蛋白质印迹、免疫组织化学和免疫荧光实验，支持炎症、糖尿病及神经退行性疾病的相关研究。

产品名称: RAGE小鼠单克隆抗体
货号: Ab349240
宿主物种: 小鼠
抗体类型: 单克隆抗体（mAb）
靶蛋白: RAGE（晚期糖基化终末产物受体）
已验证应用: 蛋白质印迹（WB）、免疫组织化学（IHC）、免疫荧光（IF）
供应商参考编号: absea#KC-2163

所需材料与试剂

开始实验前，请准备以下材料：

RAGE小鼠单克隆抗体（Ab349240）——一抗
偶联HRP（用于WB/IHC）或荧光基团（用于IF）的适当二抗
PVDF或硝酸纤维素膜（用于WB）
封闭液：TBST中5%脱脂奶粉或5% BSA（用于WB）；PBS中10%正常血清（用于IHC/IF）
根据实验用途准备细胞或组织裂解液、FFPE组织切片或盖玻片上的培养细胞
TBST（含0.1% Tween-20的Tris缓冲盐水）
PBS（磷酸盐缓冲盐水）
抗原修复缓冲液（用于IHC；如pH 6.0柠檬酸盐缓冲液或pH 9.0 EDTA缓冲液）
DAB或AP底物（用于IHC显色检测）
适合各应用的封片剂
标准SDS-PAGE电泳设备（用于WB）

注意：最佳稀释比例和实验条件应由最终用户通过预实验确定。请参阅产品说明书以获取最新建议。

蛋白质印迹（WB）实验方案

按以下步骤通过蛋白质印迹法检测RAGE：

样品制备：使用含蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液裂解细胞或匀浆组织。通过BCA法或Bradford法测定蛋白质浓度。在SDS上样缓冲液中95–100 °C煮沸5分钟。
SDS-PAGE：在适当浓度的聚丙烯酰胺凝胶上每孔上样20–40 µg总蛋白。以100–120 V电压电泳至染料前沿到达凝胶底部。
转膜：以100 V湿转60–90分钟，将蛋白质转移至PVDF或硝酸纤维素膜，或按您所用系统的建议操作。
封闭：用TBST中5%脱脂奶粉在室温下温和振荡封闭1小时。
一抗孵育：按厂商推荐稀释比例将RAGE小鼠单克隆抗体（Ab349240）稀释于封闭液中。在4 °C温和摇动条件下孵育过夜。
洗涤：用TBST洗膜3次，每次10分钟。
二抗：在室温下用适当的HRP偶联抗小鼠二抗孵育1小时。
洗涤：用TBST洗膜3次，每次10分钟。
检测：加入ECL底物，使用X光胶片或数字成像系统采集化学发光信号。RAGE应在相应分子量处显示条带。

注意：运行实验前请从产品说明书确认RAGE的预期分子量。

免疫组织化学（IHC）实验方案

按以下步骤在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片中检测RAGE：

脱蜡与复水：切片在60 °C烤箱中烘烤1小时。在二甲苯中脱蜡（3次，每次5分钟），再经梯度乙醇系列复水至蒸馏水。
抗原修复：在柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）或EDTA缓冲液（pH 9.0）中使用压力锅或微波炉进行热诱导抗原修复。将玻片冷却至室温。
消除内源性过氧化物酶：在室温下用3% H₂O₂孵育切片10–15分钟，PBS冲洗。
封闭：在室温下用PBS中10%正常血清（与二抗宿主物种匹配）封闭30–60分钟。
一抗孵育：将RAGE小鼠单克隆抗体（Ab349240）稀释于封闭液中，在湿盒中4 °C孵育过夜。
洗涤：用PBS洗涤3次，每次5分钟。
二抗与检测：在室温下用适当HRP偶联二抗孵育30–60分钟。用DAB底物显色，苏木精复染。脱水，二甲苯透明，用永久性封片剂封片。
成像：在明场显微镜下观察并拍照。

注意：特定抗原修复方法、抗体稀释比例和孵育时间应通过预实验验证。请参阅产品说明书（Ab349240）获取推荐条件。

免疫荧光（IF）实验方案

按以下步骤通过免疫荧光法在培养细胞或组织切片中检测RAGE：

细胞/组织制备：在盖玻片上培养细胞至适当密度，或制备冷冻组织切片。用PBS中4%多聚甲醛在室温固定15分钟。
通透（如需检测胞内靶点）：用PBS中0.1–0.3% Triton X-100处理10分钟。用PBS洗涤3次，每次5分钟。
封闭：用PBS中5–10%正常血清或1% BSA在室温封闭30–60分钟。
一抗孵育：将RAGE小鼠单克隆抗体（Ab349240）稀释于封闭液中，在4 °C孵育过夜或室温孵育1–2小时。
洗涤：用PBS洗涤3次，每次5分钟。
二抗：在室温避光条件下用适当荧光基团偶联抗小鼠二抗孵育1小时。
核复染（可选）：用DAPI（1 µg/mL）孵育5分钟，PBS洗涤。
封片：用抗荧光淬灭封片剂封片，指甲油密封。
成像：使用荧光显微镜在适当激发/发射滤光片组下成像。

注意：IF实验中的具体抗体稀释比例须通过预实验确定。RAGE可能根据细胞类型和生理状态表现出膜定位或胞质定位，解读结果前请验证预期定位。

故障排查与实验技巧

无信号或信号弱：检查抗体存储条件是否正确且未过期。优化一抗浓度。确认IHC实验是否进行了抗原修复。检查二抗是否与小鼠来源一抗兼容。
背景高：延长封闭时间或提高封闭液浓度。增加洗涤次数或延长洗涤时间。降低一抗或二抗浓度。IHC实验中确保内源性过氧化物酶活性被完全淬灭。
非特异性条带（WB）：降低抗体浓度。提高洗涤严格性。确认样品类型和上样量是否正确。
染色不一致（IHC/IF）：标准化抗原修复条件。孵育步骤中避免切片干燥。确保抗体稀释比例和孵育时间一致。
阳性对照建议：使用已知表达RAGE的细胞系或组织（如肺组织、内皮细胞）作为阳性对照，以确认实验性能。
保存：按照说明书指导保存RAGE小鼠单克隆抗体（Ab349240），避免反复冻融。

常见问题

RAGE小鼠单克隆抗体（Ab349240）已验证适用于哪些实验应用？

RAGE小鼠单克隆抗体（Ab349240）已验证可用于蛋白质印迹（WB）、免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）实验。请始终参阅产品说明书获取最新已验证应用列表及推荐稀释比例。

RAGE小鼠单克隆抗体用于蛋白质印迹时推荐的一抗稀释比例是多少？

具体稀释比例请以Ab349240产品说明书为准，因最佳浓度可能因批次和应用而异。一般而言，单克隆抗体用于WB的起始稀释范围通常为1:500至1:2000，但仍需通过实验进行优化。

验证RAGE检测时应使用哪种阳性对照组织或细胞系？

RAGE在多种组织中广泛表达，肺组织和血管内皮细胞常被作为阳性对照。请参阅已发表文献或Ab349240产品说明书确认合适的阳性对照。

应如何保存RAGE小鼠单克隆抗体（Ab349240）以保持其活性？

请按产品说明书指导保存抗体，通常长期保存于-20 °C，短期使用保存于4 °C。避免反复冻融，以免影响抗体性能。

使用RAGE小鼠单克隆抗体进行IHC时出现高背景的可能原因是什么？

IHC中高背景可能由封闭不充分、内源性过氧化物酶灭活不完全、一抗或二抗浓度过高或洗涤不充分所致。请系统优化每个步骤，并设置无一抗阴性对照以确定背景来源。

参考文献

Aladdin Scientific. RAGE Mouse mAb (Ab349240) Product Datasheet. Aladdin Scientific.
Bierhaus A, et al. Understanding RAGE, the receptor for advanced glycation end products. J Mol Med. 2005.
Yan SF, Ramasamy R, Schmidt AM. The RAGE axis: a fundamental mechanism signaling danger to the vulnerable vasculature. Circ Res. 2010.

产品仅供科研与开发使用，不用于人体、动物、诊断或治疗。

目录：实验方案（Protocols）

探索主题：蛋白质印迹免疫组织化学免疫荧光实验方案小鼠单克隆抗体 RAGE抗体

Da — 若无特别说明，分子量单位默认为道尔顿。 Mw — 重均分子量。 Mn — 数均分子量。