本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

操作方法

用T4噬菌体DNA聚合酶标记双链DNA的3'端

材料与仪器

限制性内切核酸酶 T4 噬菌体 DNA 聚合酶 模板 DNA
醋酸氨 乙醇 酚 氯仿 T4 噬菌体 DNA 聚合酶缓冲液 dNTP 溶液
Sephadex G-50 离心柱 水浴

步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

醋酸氨（10 mol/L)

乙醇

酚：氯仿（1:1，V/V)

2. 酶和缓冲液

适当的限制性内切核酸酶

T4 噬菌体 DNA 聚合酶

10X T4 噬菌体 DNA 聚合酶缓冲液

3. 核酸和寡核苷酸

含三种来标记的 dNTP 溶液，浓度各为 2 mmol/L

含一种未标记的浓度为 2 mmol/L 的 dNTP 的溶液

模板 DNA ( 0.1~5 μg )

4. 放射性复合物

[α-³²P] dNTP ( 10 mCi/ml，比活性为 800~3000 Ci/mmol）

5. 专用设备

Sephadex G-50 离心柱，用 TE ( pH 7.6) 平衡

预设定至 70℃ 的水浴

二、方法

1. 用产生平端或 3' 突出端的限制酶消化 0.1~5.0 μg 模板 DNA。

2. 用酚: 氯仿抽提及在 2.5 mol/L 乙酸铵的存在下用乙醇沉淀纯化 DNA。

3. 将 DNA 沉淀溶于：

10X T4 噬菌体 DNA 聚合酶缓冲液       2 μl

2 mmol/L 三种未标记的 dNTP 溶液     1 μl

10 mCi/ml [α-³²P] dNTP

( 800~3000 Ci/mmol）                       1 μl

T4 噬菌体 DNA 聚合酶（2.5 单位/μl） 1 μl

水                                                     加至 20 μl

37℃ 温育 5 min。

4. 加入 1 μl 2 mmol/L 未标记的第四种 dNTP 溶液，继续温育 10 min。

5. 70℃ 加热 5 min 以终止反应。

6. 用 Sephadex G-50 离心柱层析或在 2.5 mol/L 乙酸铵的存在下进行两轮乙醇沉淀分离标记的 DNA 与未掺入的 dNTP。

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