大鼠视神经少突胶质细胞培养可以：

（1）获得大鼠视神经少突胶质细胞；（2）用于视神经损伤修复研究；

（3）用于少突胶质细胞相关课题研究。

操作方法

牛血清培养法

原理

采用视神经，DMEM/F12条件培养基培养，观察细胞形态及生长，并进行免疫组织化学鉴定。

材料与仪器

Wistar大鼠
亚硒酸钠 腐胺 转铁蛋白 胰岛素 甲状腺素 黄体酮 谷氨酰胺 小牛血清 兔抗鼠GC抗体
眼科剪 滴管 离心机 培养皿 CO2培养箱

步骤

一、实验步骤

1.  取新生2 d 的Wistar大鼠10 只，无菌条件下取出双侧视神经。   2.  接种至24孔培养板内经多聚赖氨酸处理的盖玻片上。   3.  加入含30g·L^-1 小牛血清的DMEM/F12 培养基，37℃，50mL/L CO₂，100%湿度连续培养3 d 。   4.  3 d 后弃废液，改为含 5g·L^-1 小牛血清DMEM/F12 条件培养液继续培养。   5.  每周换液2次。在获得足够的细胞数量后，改用无血清条件培养液继续培养，每2 d 换液一次。
二、形态学观察

每天在倒置显微镜，观察培养细胞的生长过程和形态学变化并拍照。

三、免疫细胞化学鉴定

1.  将含细胞盖玻片取出，0.01 mol·L^-1 PBS冲洗3 次x5 min。

2.  冷丙酮固定10 min。

3.  PBS冲洗(3 次x5 min)。

4.  30g·L^-1 过氧化氢室温孵育15 min。

5.  PBS冲洗3 次x5 min。

6.  滴加正常山羊血清，室温孵育20 min。

7.  滴加1:100 GC抗体，阴性对照以PBS代替一抗，37℃孵育60 min。

8.  PBS冲洗3 次x5 min。

9.  滴加 生物素标记羊抗兔IgG，37℃，20 min。

10.  PBS冲洗3 次x5 min。

11.  滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液。

12.  DAB工作 液显色，自来水终止反应。

13.  脱水，透明，DPX封片保存。
四、结果

1. 形态学观察结果

组织块24 h 开始贴壁，48～72 h 可见神经组织边缘游出少量细胞，主要为圆形或梭形(图 1)。8～9 d 左右，细胞基本铺满培养孔。此时改用无血清条件培养基培养进行纯化。培养过程中，部分细胞死亡。

12 d 左右获得的细胞胞体基本为呈圆形或多角型，直径约 6～10μm。细胞核较大，胞质少(图 2)。

2. 免疫组织化学染色结果

培养的视神经少突胶质细胞的免疫组织化学染色 GC 蛋白阳性，未加一抗的呈阴性。染色结果显示成熟的少突胶质细胞突起丰富，互相形成蜘蛛网状(图 3)。苏木素复染，异质细胞较少，90%以上为阳性细胞(图 4)。

Figure 1 Cells migrated from optic nerve tissue at the third day (10x10) 图 1. 培养第 3 天，细胞自视神经迁出 (10x10)

Figure2 Purified oligodendrocytes of optic nerve at the fifteenth day (10x40) 图 2. 培养第 15 天，纯化的视神经少突胶质细胞(10x40)

Figure 3 Positive expression of GC in oligodendrocytes at the seventh day (10x20) 图 3. 培养第 7 天，少突胶质细胞 GC 阳性表达 (10x20)

Figure 4 Positive expression of GC in purified oligodendrocytes at the fifteenth day (hematoxylin staining) (10x20) 图 4. 培养第 15 天，纯化的少突胶质细胞 GC 阳性表达(苏木素复染)(10x20)

注意事项

1. 体外研究发现甲状腺素、胰岛素、转铁蛋白、腐胺、黄体酮和微量元素硒等，可使O2A 祖细胞朝少突胶质细胞定向分化。

2. 而血清等可以诱导O2A祖细胞分化为Ⅱ型星形胶质细胞。 逐步减少条件培养基中的血清浓度，促进O2A祖细胞向少突胶质细胞分化。

常见问题

免疫染色鉴定结果表明纯度较高超过 90%。此方法简便、可靠、易于推广，便于对少突胶质细胞相关课题进行研究。

一、讨论

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