从丙烯酰胺凝胶上切下潜在的差异表达 cDNA 之后，用同一种锚定-任意引物组合重新扩增 cDNA, 反应条件与最初 PCR 相同。重新扩增的产物，可以进行克隆和测序，以供进一步分析。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。

操作方法

差异表达cDNA的重新扩增、克隆与测序实验

材料与仪器

琼脂糖凝胶 蒸馏水 DNA 点样染料 甘油 蒸馏水 溴酚蓝 二甲苯腈 FF 溴化乙锭溶液 任意引物（H-AP) cDNA dNTP 混合液 未标记的锚定引物 载体特异性引物 PCR 缓冲液 Tris-HCl KCl MgCl2 明胶 TaqDNA 聚合酶
电泳装置 离心管 热循环仪 薄壁 PCR 管 UV 透射仪 微波炉

步骤

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

1.5% 琼脂糖凝胶，加溴化乙锭 (见第 9 步）

蒸馏水

DNA 点样染料

30% 甘油

70% 蒸馏水

0.003% 溴酚蓝

0.003% 二甲苯腈 FF(GenHunterS403)

溴化乙锭溶液（0.5ug/ml)

蒸馏水

重新扩增混合液（见第 7 步）

2. 核酸和寡核苷酸

任意引物（H-AP)(2 mmol/L)

cDNA(切割的条带），来自方案 5

dNTP 混合液（250umol/L)(GenHunterS501)

未标记的锚定引物（H-T11M)(2umol/L)

载体特异性引物 [Lseq/Rseq(GenHunter)]

3. 酶和酶缓冲液

10XPCR 缓冲液

100 mmol/LTris-HCl,pH8.4

500 mmol/LKCl

15 mmol/LMgCl₂

0.01% 明胶

TaqDNA 聚合酶（Qiagen201207)

4. 专用设备

电泳装置

1.5 ml 离心管

Parafilm

热循环仪

0.2 ml 薄壁 PCR 管（GenHunterT101)

UV 透射仪

微波炉

5. 附加试剂

PCR-TRAPCloningSystem(GenHunterP404), 包括准备好插入的 PCR-TRAP 克隆载体、T4DNA 连接酶（200u/ul)、蒸馏水、10X 连接缓冲液（500 mmol/LTris-HCl、pH7.8,100mmol/LMgCl₂，100nimol/LDTT，10 mmol/LATP，500ul/mlBSA) 和GH-competent RNA spectra Fluorescent mRNA 差异显示系统（GenHunterF501-F510R501-R510，或者S201)

6. 细胞
GH-competent 细胞

7. 特别项目

含有抗生素的琼脂平板（参考克隆系统推荐的专用抗生素与方案）

二、方法

1. 将方案 5 中切下的条带，放到 1.5 ml 离心管中，加入 1ml 蒸馏水。

2. 浸泡 30 min，时常涡旋混匀。

3. 除去蒸馏水（不要丟掉条带），再加入 50ul 新鲜的蒸馏水。

4. 将离心管盖紧（用 Parafilm 封住），煮沸 15 min，将 cDNA 从凝胶中洗提出来。

5. 离心 lmin，浓缩并收集凝胶。

6. 将上清液转移到一个新的 1.5 ml 离心管中，弃去装有凝胶的管子。

7. 在 0.2 ml 薄壁 PCR 管中，加入下列组分完成 cDNA 的重新扩增。

蒸馏水                                                  22.6ul

10XPCR 缓冲液                                    4.0ul
 
dNTP 混合液（250umol/L)                   1.0ul

H-AP 引物（2umol/L)                           4.0ul

H-T₁₁M(2umol/L)                                  4.0ul

cDNA 模板                                            4.0ul

Taq DNA 聚合酶                                    0.4ul

8. 将重新扩增的反应液放在热循环仪上，以最初 PCR 条件（见方案 4 第 1 步）进行反应。

9. 配制含有溴化乙锭的 1.5% 琼脂糖凝胶。

a. 在玻璃烧瓶中，称 1.5 mg 超纯的电泳级琼脂糖。

b. 加 1XTAE 至 100 ml。

c. 将琼脂糖放到微波炉中熔化。

d. 冷却后，加入 3ul1:1 的溴化乙锭溶液。

e. 混匀后，倒入凝胶装置中。

f. 放好梳子，等胶凝固。

g. 电泳缓冲液为 1XTAE 溶液（凝胶装置不同，用量也不同）。

10. 在 0.5 ml 的离心管中，加入 30ul 的再扩增反应液和 5ul DNA 点样染料。将混合液全部加到 1.5% 琼脂糖凝胶上。

11. 在 70V 电压下电泳大约 45 min。

12. 用 UV 透射仪进行观察，以确认 cDNA 再扩增反应产物。

13. 按照厂商给的方案，将差异表达的 cDNA 克隆到推荐的 PCR-TRAP 克隆载体或其他合适的载体中。

14. 如果使用的是 PCR-TRAPCloningSystem，可以使用提供的载体特异性引物进行测序。如果使用其他的克隆载体，请参考厂商的测序说明书。

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