蛋白质翻译后修饰（post-translational modifications，PTMs）泛指蛋白质在翻译过程中或翻译后发生的共价加工事件，包括蛋白水解切割，以及化学基团、小分子或蛋白质修饰分子的共价添加与移除，并由此调节蛋白质活性、稳定性、亚细胞定位及分子相互作用。磷酸化、泛素化、SUMO化、糖基化、甲基化、乙酰化和乳酸化等修饰共同参与信号转导、代谢调控、基因表达、DNA损伤修复和免疫应答。

        关键词：蛋白质翻译后修饰；泛素化；SUMO化；磷酸化；糖基化；甲基化；乙酰化；乳酸化；修饰蛋白质组学；质谱分析

1 蛋白质翻译后修饰的类型与功能

1.1 蛋白质翻译后修饰的调控作用

        翻译后修饰可改变氨基酸残基的电荷、空间位阻和化学性质，进而影响蛋白质构象、酶活性、稳定性、亚细胞定位及蛋白质相互作用。同一蛋白质可在不同残基上发生多种修饰，不同修饰之间还可能形成协同、竞争或顺序性调控，从而扩展蛋白质组的结构和功能多样性。

1.2 常见翻译后修饰类型

        蛋白质翻译后修饰包括磷酸化、泛素化、SUMO化、糖基化、甲基化、乙酰化、乳酸化、S-亚硝基化、脂质化、棕榈酰化、豆蔻酰化、氨甲酰化及蛋白水解加工等。不同修饰具有不同的底物残基、催化系统和生物学功能。

图1 常见蛋白质翻译后修饰类型及主要靶向残基

表1 常见蛋白质翻译后修饰的主要特征

2 修饰蛋白质组学的研究流程

2.1 样品制备与蛋白质酶解

        组织、细胞或体液样品经裂解后提取总蛋白，再通过还原、烷基化和蛋白酶酶解获得肽段混合物。样品制备过程中应根据目标修饰加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、去泛素化酶抑制剂或去乙酰化酶抑制剂，减少样品处理引起的修饰丢失。

2.2 修饰肽段富集

        多数修饰肽段丰度较低，需要在质谱检测前进行选择性富集。磷酸肽可采用固定化金属离子亲和色谱或金属氧化物亲和方法；糖肽可采用凝集素、亲水相互作用色谱或化学衍生方法；泛素化位点可通过识别胰蛋白酶酶解后赖氨酸残基上双甘氨酸残基标记的抗体富集；乙酰化、甲基化和乳酸化肽段可采用修饰特异性抗体富集。

2.3 质谱检测与位点定位

        液相色谱-串联质谱可根据前体离子的质量变化识别修饰类型，并利用二级质谱碎片离子确定肽段序列和修饰位置。同一肽段存在多个候选修饰残基时，应结合位点定位概率、特征碎片离子及重复样本结果评价位点可信度。

2.4 生物信息学分析

        质谱数据经数据库检索后可获得修饰肽段、修饰位点和对应蛋白质信息，并进一步进行差异修饰分析、序列基序分析、蛋白质功能注释、亚细胞定位、信号通路富集和蛋白质相互作用网络分析。修饰组数据还应结合总蛋白质组数据，区分修饰比例变化与蛋白质总量变化。

2.5 表型与机制验证

        候选修饰位点可通过氨基酸突变、蛋白质敲低或敲除、修饰酶抑制剂处理及重组蛋白实验进行验证。机制研究可进一步分析修饰位点对酶活性、蛋白质稳定性、亚细胞定位、复合物形成及细胞表型的影响。

表2 修饰蛋白质组学的主要研究环节

3 翻译后修饰相关数据库与可视化工具

3.1 蛋白质与酶学数据库

        UniProt可用于查询蛋白质序列、功能、亚细胞定位及已知修饰位点；PIR提供蛋白质序列分类和功能注释信息；BRENDA主要用于查询酶催化反应、底物、动力学参数和抑制剂信息。

3.2 翻译后修饰数据库

        PhosphoSitePlus整合了哺乳动物蛋白质的磷酸化、泛素化、乙酰化和甲基化等修饰信息；PTMD收集翻译后修饰与人类疾病之间的关联证据；PROSITE可根据蛋白质序列识别功能结构域、保守基序和潜在功能区域。

3.3 蛋白质结构与位点可视化

        PyMOL和Chimera可用于显示蛋白质三维结构、修饰残基位置及其与配体或相互作用蛋白的空间关系。修饰位点可映射至蛋白质结构域、催化中心或分子相互作用界面，用于分析修饰对蛋白质功能的潜在影响。

表3 翻译后修饰研究常用数据库与软件

4 蛋白质泛素化

4.1 泛素化反应过程

        泛素化由泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3依次催化。E1利用ATP激活泛素，并与泛素C端形成硫酯键；活化的泛素随后转移至E2的半胱氨酸残基；E3识别底物蛋白并促进泛素连接至底物的赖氨酸或其他受体位点。

4.2 泛素链类型及其功能

        底物蛋白可发生单泛素化、多位点单泛素化或多聚泛素化。K48连接的多聚泛素链主要参与蛋白酶体降解，K63连接泛素链主要参与信号转导、膜运输、DNA损伤修复和自噬调控。泛素还可通过K6、K11、K27、K29、K33及M1等位点形成不同链型。

4.3 去泛素化调控

        去泛素化酶可切除底物蛋白上的泛素或编辑泛素链结构，使泛素化成为动态可逆的调控过程。泛素连接酶、去泛素化酶和蛋白酶体活性异常可破坏蛋白质稳态，并影响细胞周期、凋亡、免疫和肿瘤相关信号。

4.4 泛素化研究方法

        泛素化可采用基于活性的探针检测泛素化酶或去泛素化酶活性，也可通过泛素标签、免疫沉淀-免疫印迹和质谱分析评价目标蛋白泛素化。泛素化组学通常结合双甘氨酸残基肽段富集和高分辨质谱，系统分析泛素化位点及其变化。

5 蛋白质SUMO化

5.1 SUMO成熟与转移

        SUMO前体首先由SUMO特异性蛋白酶加工，暴露C端双甘氨酸基序，形成成熟SUMO。成熟SUMO经E1以ATP依赖方式激活后转移至E2 Ubc9，Ubc9可直接催化SUMO与底物赖氨酸形成异肽键，而SUMO E3连接酶可在许多反应中提高底物选择性和连接效率，但并非所有SUMO化反应都必需E3。

5.2 去SUMO化调控

        SENP家族蛋白既参与SUMO前体加工，也可去除底物蛋白上的SUMO。SUMO连接和去SUMO化之间的动态平衡决定底物蛋白的修饰水平、亚细胞定位及功能状态。

5.3 SUMO化的生物学功能

        SUMO化主要参与蛋白质稳定性、核质转运、转录调控、染色质组织、细胞周期及DNA损伤修复。SUMO化通常不直接介导蛋白酶体降解，但可通过改变蛋白质相互作用或与泛素系统交叉调控影响底物稳定性。

6 蛋白质磷酸化

6.1 磷酸化与去磷酸化

        真核细胞中的经典丝氨酸/苏氨酸激酶和酪氨酸激酶主要将ATP的γ位磷酸基团转移至底物蛋白的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基，而组氨酸和天冬氨酸等残基也可发生非经典磷酸化。磷酸基团可改变局部电荷、蛋白质构象和分子结合能力，蛋白质磷酸酶则通过去除磷酸基团终止或重新调节信号。

6.2 磷酸化的生物学功能

        磷酸化可快速调节酶活性、受体信号和蛋白质相互作用，参与细胞增殖、分化、代谢、细胞周期、凋亡及免疫应答。连续的激酶和磷酸酶反应可形成信号级联、反馈调控及通路交叉。

6.3 磷酸化研究方法

        磷酸化研究可采用激酶活性测定、磷酸酶处理、放射性ATP标记、磷酸化特异性抗体、ELISA、抗体芯片、流式细胞术及磷酸化蛋白质组学。质谱分析前通常需要富集磷酸肽，以提高低丰度磷酸化位点的检出率。

7 蛋白质糖基化

7.1 糖基化的主要类型

（1）N-糖基化

        N-糖基化主要发生于天冬酰胺残基，在内质网中起始并在高尔基体中进一步加工，参与蛋白质折叠、质量控制、运输和分泌。

（2）O-糖基化

        O-糖基化主要发生于丝氨酸或苏氨酸残基，糖链结构和修饰位置具有较高多样性，参与黏蛋白形成、细胞信号和蛋白质稳定性调控。

（3）C-糖基化

        C-糖基化主要表现为糖基与特定色氨酸残基形成

        碳-碳键，常见形式为C-甘露糖基化，可影响蛋白质折叠、分泌和受体功能。

7.2 糖基化的生物学功能

        糖基化广泛存在于分泌蛋白和膜蛋白，可调节蛋白质折叠、降解、分泌、运输和清除，并参与细胞黏附、细胞识别、受体激活、内吞和免疫应答。细胞核和细胞质中的部分糖基化修饰结构相对简单，但具有较强动态性。

7.3 糖基化研究方法

        糖基化可通过凝集素结合、糖苷酶处理、糖基转移酶活性测定、色谱分离和质谱分析进行研究。糖蛋白质组学通常采用凝集素亲和、亲水相互作用或化学标记方法富集糖蛋白和糖肽，并结合质谱鉴定糖链组成、糖基化位点和载体蛋白。

8 蛋白质甲基化

8.1 赖氨酸甲基化

        赖氨酸侧链的ε-氨基可发生单甲基化、二甲基化和三甲基化。不同甲基化程度和修饰位点可形成不同的蛋白质识别界面，参与异染色质形成、基因转录激活或抑制及DNA损伤应答。

8.2 精氨酸甲基化

        精氨酸可发生单甲基化、不对称二甲基化和对称二甲基化。精氨酸甲基化可调节RNA结合、蛋白质相互作用、转录调控、信号转导和核质运输。

8.3 甲基化研究方法

        蛋白质甲基化可通过修饰特异性抗体、免疫印迹、免疫荧光、免疫沉淀和质谱分析检测。组蛋白甲基化还可结合ChIP-qPCR或ChIP测序，分析特定修饰在染色质区域的分布及其与基因转录的关系。

9 蛋白质乙酰化

9.1 乙酰化的主要形式

        蛋白质乙酰化主要包括N端乙酰化和赖氨酸乙酰化。N端乙酰化发生于蛋白质N端，通常较为稳定；赖氨酸乙酰化由赖氨酸乙酰转移酶催化，并可被组蛋白去乙酰化酶或Sirtuin家族蛋白去除。

9.2 乙酰化的调控作用

        赖氨酸乙酰化可中和其正电荷，改变蛋白质与DNA、RNA或其他蛋白质的结合。乙酰化参与染色质开放、基因表达、代谢酶活性、蛋白质稳定性、核质转运、细胞周期和细胞骨架调控。

9.3 乙酰化研究方法

        乙酰化可采用总乙酰赖氨酸抗体或位点特异性抗体进行免疫印迹、免疫荧光和免疫沉淀，也可通过乙酰转移酶或脱乙酰酶活性测定及质谱分析检测。乙酰化蛋白质组学通常结合抗乙酰赖氨酸抗体富集和LC-MS/MS鉴定差异修饰位点。

10 蛋白质乳酸化

10.1 乳酸化的代谢基础

        乳酸化是连接乳酸代谢与蛋白质功能调控的一类赖氨酸酰化修饰。糖酵解增强、缺氧或乳酸积累可改变细胞内乳酸及相关代谢中间体水平，进而影响组蛋白和非组蛋白的赖氨酸乳酸化状态。

10.2 乳酸化的生物学功能

        组蛋白乳酸化可影响染色质状态和基因表达，并参与炎症调控、免疫细胞功能、肿瘤免疫逃逸、肿瘤细胞迁移、血管生成、治疗耐受和细胞外基质重塑。乳酸化水平还受到乳酸生成、乳酸转运、氧供应及细胞代谢状态影响。

10.3 乳酸化研究方法

        乳酸化可通过泛乳酸化赖氨酸抗体进行免疫印迹、免疫荧光和免疫沉淀分析。液相色谱-串联质谱可鉴定乳酸化肽段和具体位点，并用于比较不同处理条件下乳酸化蛋白质组的变化。

11 翻译后修饰研究的实验设计

11.1 样品处理与修饰保存

        蛋白质提取应在低温条件下进行，裂解液组成、样品处理时间和离心条件应在各组间保持一致。对于动态性较强的修饰，应快速终止细胞反应并加入相应抑制剂，避免样品处理过程中发生去磷酸化、去泛素化或去乙酰化。

11.2 修饰富集与总蛋白校正

        修饰组学不仅需要比较修饰肽段丰度，还应检测对应蛋白质的总表达量。目标修饰增加可能来源于单位蛋白修饰比例升高，也可能由蛋白质总量增加造成，因此应结合总蛋白质组、目标蛋白质免疫印迹或免疫沉淀结果进行校正。

11.3 位点鉴定与功能突变

        质谱鉴定的候选位点需结合定位概率、重复样本、碎片离子覆盖度和修饰肽段丰度进行筛选。位点功能验证可将赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸替换为不能接受相应修饰的残基，并比较突变前后的蛋白质活性、稳定性、定位和细胞表型。

11.4 多种修饰的联合分析

        同一蛋白质可同时发生磷酸化、泛素化、乙酰化、甲基化或乳酸化，不同修饰可能发生协同、竞争或顺序性调控。联合分析应结合位点距离、时间变化、修饰酶活性及蛋白质功能，避免将单一修饰变化直接解释为最终生物学效应。

11.5 常见结果解释问题

12 蛋白质翻译后修饰研究相关产品

参考文献

[1] Zhong Q, et al. Protein posttranslational modifications in health and diseases: Functions, regulatory mechanisms, and therapeutic implications. MedComm (2020). 2023 May 2;4(3):e261.

[2] Luo P, et al. The role of SUMOylation in the neurovascular dysfunction after acquired brain injury. Front Pharmacol. 2023 Mar 22;14:1125662.

[3] Reily C, et al. Glycosylation in health and disease. Nat Rev Nephrol. 2019 Jun;15(6):346-366.

[4] Izzo LT, et al. Histone lactylation links metabolism and gene regulation. Nature. 2019 Oct;574(7779):492-493.

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[1] 磷酸化与磺酸化修饰多肽

[2] 生物制药中的糖基化修饰

[3] 泛素系统的结构编码与蛋白质稳态调控机制

[4] 泛素-蛋白酶体系统（UPS）

[5] SUMO标签级试剂