快速复苏细胞，缓慢稀释，以高细胞密度重新接种

来源：动物细胞培养：基础技术指南第五版

操作方法

方案20.2复苏冻存细胞实验

原理

快速复苏细胞，缓慢稀释，以高细胞密度重新接种（图20.9）。

步骤

材料

无菌

培养瓶（如果需要离心时）

生长培养基

吸量管，1ml，10ml

注射器和19号针头（如果你使用玻璃冻存管）

非灭菌

保护性手套和面罩

37℃无菌水，10cm深，盛于清洁、用乙醇擦拭过的带盖的水桶中

镊子

70%乙醇

棉签

1%萘黑（酰胺黑）或0.4%台盼蓝

操作步骤

1.检查冻存目录，确定将要复苏的冻存管的位置

2.收集所有材料，准备培养基，标记培养瓶

3.从冻存罐中取出冻存管，检查标签，确定是否是所需要的冻存管，若小管未浸没在液氮中，将小管放入塑料除菌水桶内37℃的烧杯中。尽可能避免水没过官帽，因为会增加污染的机会。

安全提示

将冻存管从液氮中取出时，必须穿实验衣，戴手套。若冻存管浸没在液氮中，则必须待面罩或护目镜，也必须穿实验衣戴手套。储存在液氮中的冻存管，包括塑料小管都可能吸入液氮，复苏时将可能发生剧烈爆炸。该种情况下，必须使用带盖的塑料水桶进行复苏，以控制爆炸。

4.当冻存管复苏时，再次检查标签以确定为所需的细胞；随后用70%乙醇彻底擦洗冻存管，然后在超净工作台内打开冻存管，

5.用1ml吸管将冻存管内含物转移至培养瓶中。

6.将培养基缓慢的加至细胞悬液中:以每2min 10ml的速率进行滴加。开始时逐滴加入，然后可加快，逐渐稀释细胞和细胞保护剂。

对于需要通过离心去除细胞保护剂的细胞：

（a）按照步骤6，在离心管或常规容器内缓慢稀释细胞。

（b）100g离心2min。

（c）弃去含有细胞保护剂的上清培养液。

（d）以新鲜培养基重新悬浮细胞。

（e）接种入培养瓶。

7.冻存管内残留物可用萘黑或台盼蓝染色，以测定细胞的存活率（见方案22.3.1）。

8.24h后检查：

（a）对于贴壁单层细胞，依据预测密度（个细胞/cm2)的细胞照片，确认细胞是否贴壁，估计细胞存活率（见13.6.1节，16.4.5节；彩图4）。

（b）对于悬浮生长的细胞，检查外观（清晰的细胞质，缺乏细胞颗粒），稀释至常规的接种浓度。若进行细胞技术，并估计细胞存活率（见22.3.1节）后，接种浓度可能更精确，这种情况下， 可以将细胞稀释至常规存活细胞接种浓度。

注意事项

1. 将冻存管从液氮中取出时，必须穿实验衣，戴手套。若冻存管浸没在液氮中，则必须待面罩或护目镜，也必须穿实验衣戴手套。储存在液氮中的冻存管，包括塑料小管都可能吸入液氮，复苏时将可能发生剧烈爆炸。该种情况下，必须使用带盖的塑料水桶进行复苏，以控制爆炸。

2. 塑料冻存管在使用前要仔细检查，以防管壁破裂或螺口不配套造成密封 不严。

3. 用DMSO作为冻存保护剂时，用前应先将冻存液在4℃预冷，解冻后应马 上洗去保护剂。

常见问题

1. 检查细胞活率。用1ml培养液重悬细胞，台盼蓝染料排除法检查细胞存活率。

2. DMSO有剧毒，使用时要特别注意。此外，在冻存前越晚加入细胞越好，解冻后要尽快除去，以避免对细胞的毒害。

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