研究细胞内RNA与蛋白结合情况

原理

1. 用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白。

2. 防止非特异性的RNA的结合。

3. 免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来。

4.结合的RNA序列通过microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定。

应用

细胞研究

操作方法

RIP技术

材料与仪器

【材料】细胞，抗体，磁珠
【试剂】冷PBS，RIP，RNase-free的乙醇、氯仿、异戊醇、Salt SolutionⅠ、Salt SolutionⅡ、RIP Wash Buffer、Proteinase K、10%SDS、 Precipitate EnhancerRIP Wash Buffer R、IP Immunoprecipitation Buffer、RIP Wash Buffer 、0.5M EDTA 、RNase Inhibitor
【仪器，耗材】培养皿，enpendoff管，离心机，磁力架，涡旋震荡器，冰盒，枪、枪头，超净台，360°旋转仪

步骤

（一）. 细胞裂解液获取A. 单层细胞或者贴壁细胞处理1. 冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次2. 加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来，收集至enpendoff管3. 1500rpm，4℃离心5min，弃上清，收集细胞4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后于冰上静置5min5. 每管分装200ul细胞裂解液，贮存于-80℃B. 悬浮细胞处理：先收集细胞再计数，然后清洗裂解C. 组织样品处理1.冷PBS清洗新鲜切下的组织三次2. 加入冷PBS后，用匀浆器或其他细胞分离设备使组织分散为单个细胞，计数3. 1500rpm，4℃离心5min，弃上清，收集细胞4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后置于冰上静置5min5. 每管分装200ul细胞裂解液，贮存于-80℃（二）. 磁珠的准备A. 实验前准备1、enpendoff管2、磁力架3、冰盒， RIP Wash Buffer置于冰上4、抗体，置于冰上5、涡旋震荡器6、枪、枪头放于超净台照射30min，枪喷DEPC水B. 磁珠准备过程1. 重悬磁珠2. 标记实验所需的enpendoff管，样品包括目的样品，阴性对照与阳性对照3. 吸取50ul 重悬后的磁珠悬液于每个enpendoff管4. 每管加入500ul RIP Wash Buffer，涡旋震荡5.将enpendoff管置于磁力架上，并左右转动15°使磁珠吸附成一条直线，去上清，重复一次6.用100ul的RIP Wash Buffer重悬磁珠，加入约5ug相应抗体于每个样品中7. 室温孵育30min8. 将enpendoff管置于磁力架上，弃上清9. 加入500ul RIP Wash Buffer，涡旋震荡后弃上清，重复一次10. 加入500ul RIP Wash Buffer，涡旋震荡后置于冰上（三）. RNA结合蛋白免疫沉淀A. 准备工作1、冰盒2、360°旋转仪3、RIP Wash Buffer 、0.5M EDTA 、RNase Inhibitor 置于冰上B. RNA结合蛋白免疫沉淀实验过程1.准备RIP Immunoprecipitation Buffer2.将前上步的enpendoff管放磁力架上，去上清，每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer3. 迅速解冻第一步制备的细胞裂解液，14,000rpm，4℃离心10min。吸取100ul上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中，使得总体积为1ml4. 4℃孵育3h至过夜5. 短暂离心，将enpendoff管放在磁力架上，弃上清6. 加入500ul RIP Wash Buffer，涡旋震荡后将enpendoff管放在磁力架上，弃上清，重复清洗6次（四）. RNA纯化A. 实验前准备1.枪、枪头、enpendoff管紫外照射30min，喷DEPC水以除RNA酶2. Salt SolutionⅠ、Salt SolutionⅡ、RIP Wash Buffer、Proteinase K、10%SDS、 Precipitate Enhancer 置于冰上3.RNase-free的乙醇、氯仿、异戊醇4.DEPC水置于冰上5. 离心机预冷6. 冰盒B. RNA纯化过程1.准备Proteinase K Buffer。每个样品需150ul2.用150ul Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物3. 55℃孵育30min4. 孵育完之后，将enpendoff管置于磁力架上，将上清液吸入一新的enpendoff管中5. 于每管上清液中加入250ulRIP Wash Buffer6. 于每管加入400ul苯酚：氯仿：异戊醇，涡旋震荡15s，室温下14,000rpm离心10min7. 小心的吸取350ul上层水相，吸入另一新的enpendoff管8. 于每管加入400ul氯仿，涡旋震荡15s，室温下14,000rpm离心10min9. 小心的吸取300ul上层水相，吸入另一新的enpendoff管10. 每管加入50ul Salt SolutionⅠ，15ul Salt SolutionⅡ,5ul Precipitate Enhancer ，850ul 无水乙醇(无RNase)，混合，-80℃保持1h至过夜11. 14,000rpm，4℃离心30min，小心去上清12. 用80%乙醇冲洗一次，14,000rpm，4℃离心15min，小心去上清，空气中晾干.13. 10-20ul DEPC水溶解，-80℃保存，送测序或进行下游实验。

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