检测结合抗体的方法有以下 3 种：放射化学筛选，生色反应筛选及化学发光反应筛选。3 种方法的优缺点在本章导言中有所论述。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

操作方法

筛选质粒载体构建表达文库实验

材料与仪器

封闭缓冲液 氯仿 裂解缓冲液 检测抗原-抗体复合物所用试剂 SM TNT 缓冲液 洗涤缓冲液 125I 标记的蛋白质 A 或 125I 标记的免疫球蛋白 放射性碘化第二抗体 第一抗体 LB 或 SOB 琼脂平板
空气培养箱 平头镊子 装有防水黑墨水（印度墨水）并带有 18 号针头的注射器 硝酸纤维素滤膜 塑料盒和玻璃陪氏大平皿 Whatman3 MM 滤纸 质粒表达文库

步骤

材料

缓冲液及溶液
贮存液，缓冲液及试剂的组分请见附录 1。将贮存液稀释至合适浓度。

封闭缓冲液：
10 mmol/L Tris-Cl（pH8.0)
150 mmol/LNaCl
0.05%(V/V)Tween-20
20%(V/V) 胎牛血淸
其他备选封闭液如 5%(m/V) 脱脂奶粉或含 1%(m/V) 明胶和 3%(m/V) 牛血清白蛋白的 TNT缓冲液。各种试剂的优点，不同实验室各执一辞。建议研究者进行预实验以确定哪种与筛选用第一和第二抗体合用效果最好。封闭缓冲液在 4°C 保存，可重复数次使用。应加入终浓度为 0.05%（m/V)的叠氮化钠阻抑微生物的生长。

氯仿

裂解缓冲液：
100 mmol/LTris-Cl(pH7,8}
150 mmol/LMgCl_²
1.5%(m/V) 牛血清白蛋白
1ug/ml 胰 DNA 酶Ⅰ
40ug/ml 溶菌酶

检测抗原-抗体复合物所用试剂：
利用碱性磷酸酶（AP)-偶联抗体进行生色反应筛选所用试剂
利用辣根过氧化物酶（HRP)-偶联抗体进行生色反应筛选所用试剂
利用化学发光反应筛选试剂
每种筛选方法所用的试剂，参见步骤 19, 关于检测抗体的常用方法，参见本章末信息栏中利用抗体进行免疫筛选相关内容，详情请见附录 9。

SM
室温保存，用后丢弃，以防污染。

TNT 缓冲液：
10 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
150 mmol/LNaCl
0.05%(V/V)Tween-20
毎筛选 10 张滤膜需大约 1 升 TNT 缓冲液。室温保存。

洗涤缓冲液：
含 0.1%(m/V) 牛血清白蛋白的 TNT 缓冲液
含 0.1%(m/V) 牛血清白蛋白质和 0.1%(V/V)NP-40 的 TNT 缓冲液
这些溶液中不含叠氮化钠。

放射性化合物

¹²⁵I 标记的蛋白质 A 或 ¹²⁵I 标记的免疫球蛋白

放射性碘化第二抗体
若用步骤中放射性标记第二抗体来检测抗原-抗体复合物时可用此种抗体。

抗体

第一抗体
对于第一、第二抗体的选择，参见本章末信息栏利用抗体进行免疫筛选相关内容详情请见附录 9。

培养基

LB 或 SOB 琼脂平板
含有适用于构建 cDNA 表达文库系统或载体的抗生素。90 mm 平皿中应含 30~35 ml 琼脂培养基，每 150 mm 平皿中含大约 50 ml。平板必须保持干燥，否则当硝酸纤维素滤膜移走时，顶层琼脂糖会剥离。通常，把 2 天前铺制的平板稍微打开盖，放于 37°C 继续干燥 1~2 h, 效果更好。

含 1 mmol/LIPTG 的 LB 或 SOB 琼脂平板
若表达载体携带 lac 启动子时，需要含 IPTG 的平板。关于 IPTG 诱导蛋白质表达的相关内容，请见第 15 章导言中关于含 IPTG 诱导型启动子的表达载体的讨论。

专用设备

30°C 与 42°C 空气培养箱
若表达载体中含有λ噬菌体 PR 启动子时需要（如 pEX 系列）；否则，培养箱可设 37°C。

平头镊子

装有防水黑墨水（印度墨水）并带有 18 号针头的注射器

硝酸纤维素滤膜
适用于结合蛋白质及免疫印记反应的滤膜有不含 Triton X-100 的硝酸纤维素滤膜（Millipore HATF 公司或相当产品）及硝酸纤维素衍生物如 Hybond-C extra(Amersham Pharmacia Biotech 公司），尼龙膜或带极性尼龙膜因为背景较高及固定蛋白质能力弱不适用于免疫筛选。
用软铅笔或圆珠笔在滤膜上作好记号. 用水打湿，夹于干燥 Whatman3 MM 滤纸之间. 用铝箔将一叠滤纸包好，10psi(0.70 kg/cm2) 高压蒸汽灭菌。

塑料盒和玻璃陪氏大平皿

一叠 Whatman3 MM 滤纸
毎张滤膜准备一张 Whatman3 MM 滤纸并略有富余。用铝箔包好，高压蒸汽灭菌（0.70 kg/cm2）。

载体及细菌株

质粒表达文库
按第 11 章所述利用合适表达载体构建 cDNA 文库，或从供应商处购买。

附加试剂
步骤 19 中需方案 1 中所列试剂。

方法

主板与膜的制备

1. 无菌平头镊子（如 Millipore 镊子) 将灭菌硝酸纤维素滤膜放于 LB(或 SOB) 平板上，编号面朝下。然后将滤膜移走，倒转后重新放好，编号面朝上。

2. 取少量菌液（每张 138 mm 滤膜可用小于 0.5 ml, 其中可含多达 20000 个细菌，每张 82 mm 滤膜则用小于 0.2 ml，其中可含 10000 个细菌。用灭菌弯头玻璃棒涂布在滤膜表面，在滤膜迫缘留出 2~3 mm 宽的无菌边界。室温下放置平板直至所有液体均被吸收。

3. 倒置平板，培养（8~10 h) 直至出现极小的菌落（直径 0.1 mm)。
用带有 lac 启动子的表达载体转化的菌落宜在 37°C 培养，而用带有λ噬菌体 PR 启动子表达载体转化菌落应在 30°C 培养，以防表达融合蛋白。

复印滤膜的制备

4. 将一个编号并已灭菌的硝酸纤维素滤膜与另一个含有适当抗生素的琼脂平板表面接触而使之变湿，编号面向上，复印滤膜的编号应同主滤膜编号相对应。

5. 用灭菌平头镊子轻轻把主滤膜自第一平板上（步骤 3) 移至一叠 Whatman3 MM 滤纸上。有菌落面朝上。

6. 小心把第二张已湿的滤膜（编号面向下）放在相应编号的主滤膜上。要注意，一经接触就不要移动滤膜。将一张圆形 3 MM 滤纸放于滤膜上。在滤纸上再放空皿，底部相触，用手压平皿，使滤膜得到复印。

7. 当两张滤膜夹在一起时，用 18 号针头在滤膜上作出一系列有特定记号的定位孔。轻轻剥离滤膜，将复印滤膜放于湿润用过的平板上（步骤 4), 将主滤膜放于含合适抗生素的新鲜平板上，有菌面向上。
如有需要，一张主滤膜可制备几张复印滤膜。不过，如果主滤膜要用于制备两张以上复印滤膜时应再温育若干小时以使菌落再生。通常，一张主滤膜最好只制备两张复印滤膜，以避免菌落模糊不淸而引起的种种问題。

8. 重复步骤 4~7 直至所有主滤膜被复印。

9. 按下述方法诱导克隆于带有 lac 启动子的质粒中的基因表达。

a.37°C 温育平板（主平板和复印平板）直至出现直径 1~2 mm 的菌落。一般主板的菌落很快达到所需的大小。

b. 将主板冷却至室温，包上塑料膜，4°C 保存，直至获得免疫筛选结果。

C. 将复印滤膜编号面向上放于含 lmmol/LIPTG 且预温到 37°C 的新鲜平板上。继续温育 2~4 h

d. 为诱导带λ噬菌体 PR 启动子的表达载体（如 pEX 载体请见附录 3) 进行表达合成，可把滤膜转到预温的平板上，于 42°C 温育 2~4 h。

菌落免疫筛选中滤膜的处理

10. 在化学通风橱中，用平头镊子从平板上取出硝酸纤维素滤膜，放置在湿润的纸巾上。滤膜上用一塑料盒盖好，再把一个装有氯仿的无盖玻璃平皿也放进塑料盒中。将滤膜上的细菌菌落于氯仿蒸气中暴露 15 min。

11. 将一小部分滤膜放在装有裂解液（每张 82 mm 滤膜用 6 ml, 每张 138 mm 滤膜用 12 ml) 的平皿中。所有滤膜均浸没后，将平皿放在旋转平台上，缓缓摇动裂解缓冲液，室温下菌落裂解需 12~16 h。

12. 滤膜转到含 TNT 的陪氏平皿或玻璃托盘中，室温温育 30 min。

13. 换新鲜的 TNT 缓冲液，重复步骤 12。

14. 逐张把滤膜放在含 TNT 缓冲液的玻璃盘中，用 Kimwipes 纸去除滤膜表面的菌落残迹。

表达融合蛋白克隆的检测

重要：下列各步骤切勿使滤膜干燥，本来与湿润滤膜非特异性可逆结合的抗体，一旦滤膜变干，就会永久留在滤膜上，另外滤膜浸人各种缓冲液和抗体溶液时要防止它们彼此相连，为此，可把滤膜分批（每批 5 张滤膜)，毎批单用一个大平皿或结晶血，这样就可以减少彼此相连的问题。将平皿互相叠在一起放在低速转动的平台式摇床上。

15. 所有滤膜全部剥离并漂洗后，逐张放在新换的 TNT 缓冲液中，全部滤膜都转移完毕后，于室温继续温和搅动缓冲液 30 min。
如有必要，滤膜此时可以从缓冲液中取出，用 Saran 包装膜包好，于 4°C 保存 24 h。

16. 用平头镊子把滤膜逐张转移至含封闭缓冲液（每张 82 mm 滤膜需 7.5 ml，每张 138 mm 滤膜需 15 ml) 的玻璃盘中，所有滤膜均浸没后，室温下在转动平台上慢慢摇动溶液 30 min。

17. 用平头镊子把滤膜转移至含稀释的第一抗体的封闭缓冲液（每张 82 mm 滤膜需 7.5 ml, 每张 138 mm 滤膜需 15 ml) 的新鲜玻璃盘中，使用产生背景不算很高但仍可检测 50~100pg 变性抗原的最高抗体稀释度。所有滤膜均浸没后，室溫下在转动平台上缓慢摇动 30 min。
抗体可在 4°C 保存并可反复使用数次。溶液中加入终浓度为 0.05%(V/V) 的叠氮化钠抑制微生物的生长。

18. 依次将滤膜放到下列每种缓冲液中洗涤 10 min, 在缓冲液之间转移滤膜时应逐张进行，每张 82 mm 膜各需用缓冲液 7.5 ml; 每张 138 mm 膜需 15 ml。

含 0.1% 牛血清白蛋白的 TNT 缓冲液
含 0.1% 牛血清白蛋白和 0.1%NP-40(Nondidet P-40) 的 TNT 缓冲液
含 0.1% 牛血清白蛋白的 TNT 缓冲液

19. 利用所选择的放射化学、生色反应或化学发光试剂检测抗原抗体复合物。

放射化学筛选

每张滤膜需用大约 1uCi125I 标记的 A 蛋白或免疫球蛋白，放射性标记 A 蛋白已商品化（比活 2~100uCi/ug)。放射性碘标记的第二抗体可从供应商购得，也可按材料中信息栏 IgG 的放射性碘标记相关内容进行制备。

a. 用封闭缓冲液稀释放射性标记配体（每张 82 mm 滤膜需 7.5 ml, 每张 138 mm 滤膜需 15 ml)。

b. 室温下溫育 lh, 用 TNT 缓冲液漂洗数次，按附录 9 中所述进行放射自显影。

继续步骤 20。

生色反应筛选
识别第一抗体种特异性决定簇的辣根过氧化酶（HRP) 或碱性磷酸酶（AP) 偶联的抗体可向厂商购买，并按产品说明书推荐的稀释度及要求使用。一般每张 82 mm 滤膜，可将 5ul 偶联抗血清加入 7.5ul 封闭缓冲液（无叠氮化钠）中，要了解 HRP 或 AP 更多内容，请见附录 9。
联合应用 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP) 底物及氮蓝四唑（NBT) 对抗原-抗体-抗抗体-AP 复合物进行定位

a. 将滤膜放于含 AP-偶联抗体的溶液中，于室温下缓慢摇动 1.5~2 h。

b. 按步骤 14 洗涤滤膜。

c. 制备 BCIP(50 mg/ml 溶于 100%DMT) 和 NBT(50 mg/ml 溶于 70%DMT) 贮存液，避光保存。

d. 临用前，制备 BCIP/NBT 显影液：

I. 在 AP 缓冲液中加入 33ul NBT 溶液，混匀。
II. 加 16.5ul BCIP 贮存液，混匀，避光保存，lh 内使用。

e. 用纸巾将滤膜吸干。

f. 将滤膜浸入 BCIP/NBT 显影液（每张 82 mm 滤膜用 7.5 ml, 每张 138 mm 滤膜用15 ml), 室温温育数小时。

g. 蒸馏水略洗两遍，在抗原抗体复合物处呈现深紫色。

继续步骤 20。

利用 4-氯-1 萘酚对抗原-抗体-抗抗体-HRP 复合物进行定位

a. 将滤膜放入含 HRP-偶联抗体的溶液中，于室温下轻轻摇动 1.5~2 h。

b. 按步骤 14 洗涤滤膜。

C. 将 60 mg4-氯-1 萘酚溶于 20 ml 冰预冷的甲醇制成显影液。用前，和 100 ml 含 60

ul30%H2O2 的 10 mmol/LTris-Cl(pH7.5)、l5Ommol/LNaCl 溶液混合。

d. 用纸巾将滤膜上的水吸干，再用 10 mmol/LTris-Cl(pH7.5),150 mmol/LNaCl溶液略洗一下。

e. 将滤膜浸入到 4-氯-1-萘酚显影液中（每张 82 mm 滤膜需 10 ml, 每张 138 mm 滤膜

需 25 ml)，室温温育 15~20 min。

f. 蒸馏水洗涤两遍，再抗原-抗体复合物处呈现深紫色。
生物素化的种特异性抗体及抗生物素蛋白质偶联的 HRP 也已商品化，应按不同厂商的使用说明书进行稀释，如上述 HRP-偶联抗体一样进行免疫筛选。

继续步骤 20。

发光筛选
化学发光反应是检测免疫阳性噬菌斑最灵敏的方法。第二抗体一般与 AP 或 HRP 偶联，使用 AP-偶联的抗体时需要如 1，2-dioxetane phosphates 这样的底物。这种底物磷酸化后在 466nm 波长处发光，HRP-偶联的抗体可氧化底物鲁米诺，后者在过氧化氢和苯酚存在下，可于 428nm 波长处发出强光。在两种系统中，发出的光可用放射自显影来捕获。化学发光检测快速、灵敏（1~10Pg 的抗原可被检出），且可得到永久性的筛选滤膜记录（X 射线胶片)。其潜在的缺点是试剂的高成本以及需要对放射自显影片与母板进行比较才能得到阳性克隆，下面是典型方案。

a. 将滤膜放入含 AP 或 HRP 偶联抗体的溶液中，于室温下轻缓摇动 1.5~2 h。

b. 按步骤 18 对滤膜进行洗涤。

c. 按厂家说明书制备化学发光反应底物。

d. 将洗过的滤膜与化学发光反应底物温育 1~5 min(按照厂家建议，确定最佳曝光时间)。

e. 将滤膜上多余液体除去，立即包在 Satan 包装膜中，不要使滤膜干涸。

放射自显影（请见附录 9），一般初次曝光 1 min, 然后根据此间隔来决定合适曝光时间。

继续步骤 20。

20. 鉴定阳性克隆的位置，或与复印滤膜比较，寻找一致信号。对于放射标记或化学发光探针，应将放于光箱的琼脂平板与放射自显影的结果比较。对于会在滤膜上留有可见阳性残迹的生色试剂，继续下列步骤。

a. 在滤膜上放置一叠 Saran 包装膜或 Mylar 膜。

b. 在 Saran 包装膜的表面用不同颜色的防水记号笔标记滤膜上各孔的位置，以及抗原阳性克隆的位置。Saran 包装膜上还应作好标记，以便找到与滤膜相对应的平板。

c. 把包装膜放在读片光箱表面，将含有原始菌落的平板放在膜上核对。

d. 确定阳性噬斑区域，将含有假定阳性克隆的这一区域的琼脂块移到 1 ml 含有合适抗生素的 LB 培养液中。在适当温度下培养 12~16 h。

e. 保存 Saran 包装膜作为阳性噬斑定位的永久记录。原始滤膜上的色斑会很快消退。

21. 重复铺板和筛选过程直至得到一致的免疫阳性克隆。

22. 根据方案 1 末信息栏对免疫筛选分离的克隆进行确定中提供的方法鉴定免疫筛选分离的克隆。

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