组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状、密度、离心力及介质黏度等．同一离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能使非均一的悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，从而可分批收集各种亚细胞成分。

操作方法

等渗法

原理

组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状、密度、离心力及介质黏度等。同一离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能使非均一的悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，从而可分批收集各种亚细胞成分。

材料与仪器

新鲜菠菜
氯化钠
离心机 组织捣碎机 显微镜 天平 离心管 纱布 烧杯 量筒 滴管 载玻片、盖玻片

步骤

一、实验步骤

1.  选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30 g 于150 ml 0.35 mol/L NaCI溶液中，装入组织捣碎机。   2.  利用组织捣碎机低速（5 000 r/min）匀浆3~5 min。   3.  将匀浆用6层纱布过滤于500 ml 烧杯中。   4.  取滤液4 ml 在1 000 r/min 下离心2 min。弃去沉淀。   5.  将上沾液在3 000 r/min下离心5 min。弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞陔）。   6.  将沉淀用0.35 mol/L NaCI溶液悬浮。   7.  取叶绿体悬液一消滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。   （1）在普通光镜下观察。
（2）在荧光显微镜下观察。
（3）取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再漓加一滴0.01%吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后即可以荧光显微镜下观察。   菠菜叶手切片观察用剖须刀将新鲜的嫩菠菜切削一斜面置于载片上，滴加1~2滴0.35 mol/L NaCI溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察。   （1）在普通光镜下观察。
（2）在荧光显微镜下观察。
（3）用同样方法制片，但滴加1~2滴0.01%吖啶橙染液染色1 min，洗去余液，加盖廾后即町以荧光显微镜下观察。  二、实验结果   1.  叶绿体的分离和观察   （1）普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。   （2）以Olympus荧光显微镜为例，在选用B(blue)激发滤片，B双色镜和O530（orange）阻断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。   （3）加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧色。   2.  菠菜叶手切片观察   （1）在普通光镜下可以看到三种细胞   ①表面细胞：为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞。
②保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。
③叶肉细胞：为排成栅状的长方形和椭幽形细胞。   叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。   （2）在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱。气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内叶绿体数量要比叶肉细胞少。   （3）用吖啶橙染色后，叶绿体则发出枯红色荧光，细胞核町发出绿色荧光，气孔仍为绿色。

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