在进行蛋白质（phosphorylated protein) 的结构与功能分析时，接蛋白质水解后即能将磷酸肽与未修饰的（未磷酸化的）肽分开是很有助益的。可利用的最有效的方法之一是使用载有铁 (正铁离子）的金属螯合填料。本实验来源于蛋白质纯化与鉴定实验指南，作者：朱厚础。

操作方法

用亚氨基二乙酸（铁螯合）Sepharose6B分离磷酸肽实验

材料与仪器

EDTA 乙酸铵 乙酸钠 乙酸 氯化铁 Tris-HCl Sepharose 6B 柱
SpeedVac 型旋转浓缩器

步骤

材料与设备

Sepharose 6B 柱（1x6 cm;~5 ml), 含亚氨基二乙酸（铁螯合)，（柱的理论容量为~2umol 的磷蛋白）（Pharmacia Biotech Inc.)

Tris-HCl(50 mmoI/L;pH7.6), 含 EDTA(100 mmol/L) 和 NaCl(500 mmol/L)

氯化铁（50 mmol/L)

乙酸（0.1mol/L)

乙酸钠（0.1mol/L，pH 5.0)(即，0.1mol/L 乙酸用 NaOH 调 pH 至 5.0)

乙酸铵（1%;PH6.3 和 pH8.3)

SpeedVac 型旋转浓缩器（Savant Instruments,Inc.)

EDTA(0.2mol/L;pH8.0)

操作程序

全部操作均在室温下进行。

1) 用 4 体积（20 ml) 洗亚氨基二乙酸 Sepharose 6B 柱。

2) 用 4 体积含 100 mmol/L EDTA 和 500 mmol/L NaCl 的 50 mmol/L Tris-HCl(pH7.6) 洗柱。

3) 用 4 体积 H₂O 洗柱。

4) 用 4 体积 50 mmol/L 氯化铁洗柱，以用铁饱和柱子。

5) 用 2 体积（10 ml)0.1mol/L 乙酸洗柱，去除疏松结合的铁。

6) 加肽混合物（溶于~4 ml 0.1mol/L 乙酸）于柱上。

7) 用 2 体积的 0.1mol/L 乙酸洗柱，去除未结合的肽。

8) 用 2 体积 0.1 ml/L 乙酸钠 (pH5.0) 洗柱。

9) 用 3 体积 (15 ml)1% 乙酸铵 (pH6.3) 洗柱。

10) 用 4 体积 1% 乙酸铵 (PH8.3) 洗脱磷酸肽。

11) 分部收集 0.5~1.0-ml样品。按 pH(点 pH 试纸测定之）合并样品。用 SpeedVac 型旋转浓缩器浓缩，分析磷酸肽。

12) 洗脱后，立即用 4 体积的 0.2mol/L EDTA 洗柱。无金属螯合的柱子可在室温下保存于 0.2mol/L EDTA（pH8.0) 中，并可重复使用多次。

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