本实验介绍HeLa 细胞核提取物的 Sephacryl S-300 HR 柱层析过程。本实验来源于蛋白质纯化与鉴定实验指南，作者：朱厚础。

操作方法

HeLa细胞核提取物的SephacrylS-300HR柱层析实验

材料与仪器

HeLa 细胞核提取物 Sephacryl S-300 HR 液氮 TM 缓冲液+0.1mol LKCl
XK26 40 柱

步骤

材料与设备

HeLa 细胞核提取物（从 12L 细胞培养物制得，见 pp.9l~93)(5-ml 样品)

XK26/40 柱（PharmaciaBiotech，Inc.)

Sephacryl S-300 HR(PharmaciaBiotech,Inc,)

液氮

试剂

TM 缓冲液+0.1mol/LKCl

(配方，见"试剂的配制"，pp.131~138)

操作程序

所有操作均在 4℃ 下进行。

1) 取 5-mlHeLa 细胞核提取物样品（从 12L 细胞培养物制得进行凝胶过滤层析, 留取 50ul 提取物供随后的测活分析用。

2) 对 XK26/40 柱，采用下列柱参数：

直径=2.6 cm

柱长=34 cm

体积=180 ml

流速=100 ml/h

缓冲液=TM 缓冲液+0.1mol/LKCl

3) 于 S-300 柱加 5-mlHeLa 细胞核提取物样品。分部收集 5-ml 组分。

注：凝胶过滤层析的关键一歩是样品进入填料床。样品必须以薄而均匀的圆盘状进入凝胶。在柱的底部填料是装填得最均匀也最致密的。因此，有些研究工作者喜欢在使用前将柱子倒置，然后从柱的顶端装柱时此端为柱的底部加样。另一种办法不是将柱子置，而是从柱的底部加样，使样品上行，这也是可行的。这两个方法都是将样品加在柱中填料最致密最均匀的一端。还应注意，为达到层析的高分辨率，组分的大小应取得小些，一般约为上样体积的一半。

4) 从 S-300 柱洗脱所得的各组分留取 50-ul 等分试样，供 DNA 酶 I 足迹分析实验用。转录因子 AP-1 会在 Ve/V0 值约为 1.3~1.35 处洗脱下来。其他许多转录因子如 Spl、NF-I/CTF 和 AP-2 等则会在 Ve/V0 值约为 1.35~1.40 处洗脱下来（典型的 S-300 柱的洗脱图，见图 2-2,p.95)。

5) 各组分如在 24 小时之内使用，可储存于 4℃; 若长期保存，则需液氮冷冻，并储存于-80℃ 下。

注：蛋白质溶液的冻融是蛋白质化学研究能否获得成功的重要环节之一。对此有多种方法可供选择。作者建议，蛋白质样品应尽快浸入液氮冷冻（干冰/乙醇也能满足要求。但作者不推荐直接将蛋白质样品放入--80℃ 冰箱。此外，最重要的是冷冻的蛋扫质样品应尽快解冻。蛋白质活性的丢失常常是由于解冻造成的，与冷冻过程相反，解冻的过程往往很馒。作者建议，将冷冻的蛋白质样品沒泡在室温的水中，以尽快解冻，另外，为了加快解冻过程，清除所有在容器周围可能形成的冰也很重要。

6) 用 DNA 酶 I 足迹法测定各组分中的 AP-1 的 DNA 结合活性（样品结果，见图 2-3,p.99)。

7) 含 AP-1 活性峰的 S-300 柱组分可直接上序列特异性 DNA 亲和层析柱（见实验 3)。

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