简单等位基因辨别 PCR，在基于扩增阻碍突变系统（amplifi-cation refractory mutation system，ARMS）原理的基础上设计引物，如果引物和对应的非靶 向模板之间配对，那么在引物 3'末端倒数第二个碱基处引入一个额外的错配碱基，这种方法被命 名为简单等位基因辨别 PCR（simple allel-discriminating PCR，SAP），与 CAPS 相比较，这种方法简单、成本低、功能强大而且可靠性高。目前，用于简单等位基因辨别 PCR 的方法主要有 1 种：简单等位基因辨别 PCR。

原理

简单等位基因辨别 PCR 的基本原理是为了辨别野生型和突变型等位基因间的碱基变化，在 SAP 分析中设计的一个上游引物只与 野生型配对，另一个上游引物只与突变型配对，这两个等位基因特异的引物分别与一个下游引物进行标准的 PCR 反应。引物设计基于这样的原则：如果 SNP 错配在等位基因特性引物和非模板 的靶序列之间会导致较弱的不稳定，就在引物 3' 末端倒数第二个位点引入一个强的不稳定错配。相反，如果 SNP 错配已有很强的不稳定效应，就应当在倒数第二个位置引入一个较弱的不稳定错配。如果在 SNP 错配处存在中等强度的不稳定效应，就在倒数第二个位置引入一个较弱或中等强度的错配。

设计等位基因特异性引物时，在引物 3' 末端倒数第二个位置引进的碱基应当根据表 14-2 来决定。图 14-4 (a) 说明了检测 seu-1 基因突变体引物设计的步骤。在这个例子中，末端错配是弱不稳 定的 (G-T，A-C)，因此在引物 3'末端倒数第二个位置引入强不稳定错配 (G-A)。在图 14-4 (b) 中，假设基因由 C 突变为 A, 由于末端错配 (G-A 和 T-C) 是强不稳定的，从而在倒数第二个位置 引入一个弱不稳定的错配 (T-G)，① 显示了 WT 引物与 WT 模板正确的配对，PCR 能够进行：② 显示了 MT 引物与 MT 模板稳定的配对，PCR 正常进行；③ WT 引物与 MT 模板的不稳定配对，由于连续两个错配，PCR 不能进行；④ 引物与 WT 模板的不稳定配对，PCR 不能进行。

操作方法

简单等位基因辨别PCR

原理

简单等位基因辨别 PCR 的基本原理是为了辨别野生型和突变型等位基因间的碱基变化，在 SAP 分析中设计的一个上游引物只与野生型配对，另一个上游引物只与突变型配对，这两个等位基因特异的引物分别与一个下游引物 进行标准的 PCR 反应。引物设计基于这样的原则：如果 SNP 错配在等位基因特性引物和非模板的靶序列之间会导致较弱的不稳定，就在引物 3' 末端倒数第二个位点引入一个强的不稳定错配。相反，如果 SNP 错配已有很强的不稳定效应，就应当在倒数第二个位置引入一个较弱的不稳定错配。如果在 SNP 错配处存在中等强度的不稳定效应，就在倒数第二个位置引入一个较弱或中等强度的错配。

材料与仪器

器材：PCR 扩增仪。
试剂：
① 模板：基因组 DNA；
② dNTP 混合液：每种脱氧核糖核昔酸的浓度为 2.5 mmol/L；
③ 三条特异引物：浓度均为 10 μmol/L；
④ Taq DNA 聚合酶；
⑤ 10 × PCR 缓冲液：15 mmol/L MgCl
2
，500 mmol/L KC1，100 mmol/L Tris-Cl，0.1%（体积分数）Triton X-100；
⑥ 高压灭菌去离子水；
⑦ 用于琼脂糖凝胶电泳的试剂。

步骤

简单等位基因辨别 PCR 的基本过程可分为如下几步：

利用试剂盒提取的基因组 DNA，10 ng 就可用于 20 μl 的 PCR 反应，也可使用标本中带有基因组 DNA 的样品。

设计原则见原理部分。WT 引物与 MT 引物设计的 T_m 值尽可能类似，以便使退火温度相同；通常扩增片段大小在 200~600 bp。

① 设立 50 μl 的 PCR 反应体系，SAP 分析至少需要进行两个平行的 PCR 反应，在 0.25 ml 的 PCR 管中，分别加入以下成分。

② 当 SAP 分析刚开始用于特异的 SNP 时，要尝试不同的退火温度以便确定 PCR 扩增的最佳条件。理想的条件是野生型的退火温度与突变型的相同，这样就可以进行一个 PCR 反应。但有些时候很难获得这样的条件，就需要对 WT 引物和 MT 引物进行不同的 PCR 反应。

③ PCR 产物的检测和分析反应结束后，用 10 μl 用反应液进行 1% 琼脂糖凝胶电泳分析。若试验成功，含有 WT 引物、MT 引物应当分别在其相应的模板上有扩增。

注意事项

① 太稳定的引物不能辨别目标序列和非目标序列。相反，不稳定的引物也不能有效地扩增目标序列。为了减弱引物与非模板目标序列的不需要的稳定性，可以减少引物的长度，或者升高 PCR 反应的退火温度。通常引物的（G+C）含量在 36%~66% 之间，引物的长度为 18~22 个碱基，扩增片段大小为 200~600 bp 之间，退火温度为 55~60 ℃。② WT 引物与 MT 引物长度最好相同，以便设置同样的 PCR 反应条件。当引物的最后一个碱基是 G 或 C 时，常常会增加 PCR 反应的非特异反应，这种情况下增加退火温度或缩短引物长度是必需的。③ 应当使用野生型和突变型 DNA 模板对照地进行优化 PCR 条件。当进行一个新的 SAP 分析时，利用梯度 PCR 优化反应条件是有必要的。进一步的反应条件优化也可通过调整合适的引物及 dNTP 浓度来进行。

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