实验方案（Protocols）

SP7 小鼠单克隆抗体实验方案：免疫组化（IHC）、Western blot（WB）及免疫荧光（IF）应用

· · 发布于 2026年10月3日 · 更新于 2026年10月3日 ·

SP7鼠单克隆抗体是一种靶向SP7（Osterix）转录因子的单克隆抗体，以PBS为储存液，经优化可用于免疫组织化学、蛋白质印迹及免疫荧光实验，用于检测成骨细胞系细胞。

产品货号: Ab351396
抗体类型: 鼠单克隆抗体
靶蛋白: SP7（Osterix），一种对成骨细胞分化至关重要的锌指转录因子
制剂: PBS（磷酸盐缓冲液）；无载体蛋白或防腐剂
推荐应用: 免疫组织化学（IHC）、蛋白质印迹（WB）、免疫荧光（IF）
储存建议: 储存于-20°C；避免反复冻融（PBS制剂单克隆抗体的标准要求）

所需材料

开始实验前，请确保以下试剂和仪器均已备齐：

一抗：SP7鼠单克隆抗体（Ab351396），储存于-20°C
组织/细胞样品：用于IHC的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片或冷冻切片；用于IF的培养于盖玻片上的细胞；用于WB的裂解液
封闭液：5%正常血清（种属与二抗宿主匹配）或3–5% BSA的TBST溶液
二抗：偶联HRP的抗鼠IgG（用于IHC/WB）或偶联荧光基团的抗鼠IgG（用于IF）
抗原修复缓冲液：柠檬酸缓冲液（pH 6.0）或EDTA缓冲液（pH 9.0）（用于FFPE IHC）
洗涤缓冲液：TBST（TBS + 0.1% Tween-20）或PBST
检测试剂：DAB显色底物试剂盒（IHC）、ECL发光试剂（WB）或含DAPI的封片液（IF）
仪器：高压锅或微波炉（用于抗原修复）、摇床、凝胶电泳装置（WB）、荧光显微镜（IF）

样品制备

IHC（FFPE切片）：

将切片在二甲苯中脱蜡（2 × 5 min），然后经梯度乙醇（100%、95%、70%）复水至蒸馏水。
进行热诱导表位修复（HIER）：将玻片置于柠檬酸缓冲液（pH 6.0）或EDTA缓冲液（pH 9.0）中，使用高压锅或微波炉加热10–20 min，室温冷却20–30 min。
用TBST洗涤切片三次（每次5 min）。
用甲醇中的3% H₂O₂孵育10 min，以淬灭内源性过氧化物酶活性（用于HRP检测）。
再次用TBST洗涤三次。

蛋白质印迹（WB）：

在冰上用含蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液裂解细胞或匀浆组织。
4°C、12,000 × g离心15 min，收集上清液。
用BCA法或Bradford法测定蛋白浓度。
将样品与SDS上样缓冲液混合，95°C变性5 min后上样。

免疫荧光（IF）：

用4%多聚甲醛的PBS溶液在室温固定细胞15 min。
用PBS洗涤三次。
用PBS中0.1–0.2% Triton X-100通透10 min（SP7为核转录因子，通透步骤至关重要）。
用PBS洗涤三次。

抗体孵育与检测

封闭：将样品在封闭液（5%正常血清或3% BSA的TBST/PBST溶液）中于室温孵育60 min（IHC/IF使用湿盒，WB膜温和振荡）。

一抗孵育（SP7鼠单克隆抗体，Ab351396）：

用封闭液将抗体稀释至厂家推荐的工作浓度。最佳稀释比例应根据每种应用和样品类型通过实验摸索确定。
推荐4°C温和摇动孵育过夜（适用于三种应用），或室温孵育1–2小时。

洗涤：一抗孵育后，用TBST洗涤样品3–5次（每次5 min），以去除未结合的抗体。

二抗孵育：

按推荐稀释比例将适当的抗鼠IgG二抗用封闭液稀释后加入。
室温孵育60 min；若使用荧光二抗，需避光操作。

检测：

IHC：加入DAB显色底物溶液，在显微镜下监控显色反应，用水终止反应。如需要可用苏木精复染。脱水、透明后封片。
WB：加入ECL底物，用胶片或成像系统曝光。SP7/Osterix预计在SDS-PAGE上迁移位置约为45–60 kDa。
IF：用含DAPI的封片液封片，使用相应激发/发射滤光片进行成像。

故障排查

问题	可能原因	建议解决方案
未检测到信号	抗原修复不充分；抗体稀释过度；样品中靶蛋白不表达	优化修复缓冲液种类和时间；滴定抗体浓度；使用阳性对照组织（如骨组织或骨肉瘤）
背景信号高	封闭不充分；一抗浓度过高；洗涤不充分	将封闭时间延长至2小时；降低一抗浓度；增加洗涤次数或时间
WB出现非特异性条带	抗体过量；交叉反应；转膜不完全	提高洗涤严格性；优化抗体稀释比例；用丽春红S染色验证转膜效率
IF中核信号缺失	通透不充分	提高Triton X-100浓度（最高至0.5%）或延长通透时间；SP7为核蛋白，若仅有胞质信号则提示通透失败
信号弱或不稳定	抗体降解；反复冻融	首次使用时分装为单次用量；储存于-20°C，避免反复冻融

预期结果与对照设置

预期染色模式：SP7（Osterix）是一种核转录因子，特异性表达于成骨细胞和成牙本质细胞。阳性信号应定位于细胞核。在骨组织切片中，信号预期出现在骨表面排列的成骨细胞及嵌入骨基质的骨细胞中。

阳性对照：使用来源于骨组织、骨肉瘤细胞系或已知沿成骨细胞系分化的任何细胞系的切片或裂解液。上述组织类型预期显示强SP7表达。

阴性对照：

同型对照：以相同浓度的同型匹配鼠IgG替代一抗，以评估非特异性结合。
一抗省略对照：省略一抗但继续进行后续所有步骤，以确认单独使用二抗不产生信号。

分子量（WB）：SP7/Osterix蛋白在还原性SDS-PAGE上预期出现在约45–60 kDa处。建议用阳性对照裂解液确认条带身份。

注意：所有预期结果和分子量范围均基于SP7生物学的一般知识。收到产品后请以数据表规格为准进行验证。

常见问题

SP7鼠单克隆抗体（Ab351396）的保存液是什么？应如何储存？

SP7鼠单克隆抗体（Ab351396）以PBS（磷酸盐缓冲液）为保存液，不含载体蛋白或防腐剂（如产品说明所示）。建议-20°C长期储存。为保持活性，请在首次解冻时分装为单次用量，并避免反复冻融。

SP7鼠单克隆抗体推荐用于哪些实验应用？

SP7鼠单克隆抗体（Ab351396）推荐用于免疫组织化学（IHC）、蛋白质印迹（WB）和免疫荧光（IF）。最佳工作稀释比例应针对每种应用、样品类型和检测系统通过实验摸索确定。

为什么SP7在FFPE切片IHC实验中需要进行抗原修复？推荐使用哪种修复缓冲液？

福尔马林固定会在蛋白质之间形成交联，从而掩盖表位并阻止抗体结合。热诱导表位修复（HIER）可逆转这些交联，恢复抗原性。柠檬酸缓冲液（pH 6.0）和EDTA缓冲液（pH 9.0）均常用于SP7等核转录因子；最佳修复缓冲液应针对该抗体-组织组合通过实验摸索确定。

在免疫荧光实验中使用SP7鼠单克隆抗体前，为何必须对细胞进行通透处理？

SP7（Osterix）是一种核转录因子。在标准固定条件下，细胞膜对抗体不具通透性。使用Triton X-100（0.1–0.2%）等温和去垢剂进行通透处理，可在质膜和核膜上形成孔洞，使抗体得以进入并结合核内的SP7蛋白。若省略此步骤，将导致核信号缺失或极弱。

在验证SP7鼠单克隆抗体时，应使用哪种阳性对照组织或细胞系？

骨组织切片、骨肉瘤来源细胞系或正在进行成骨分化的细胞培养物均可作为SP7抗体验证的适宜阳性对照，因为SP7/Osterix是特异性表达于成骨细胞系的主调控因子。预期不表达SP7的组织应作为阴性对照使用。

参考文献

Nakashima K, Zhou X, Kunkel G, et al. The novel zinc finger-containing transcription factor Osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 2002;108(1):17-29. doi:10.1016/S0092-8674(01)00622-5
Aladdin Scientific. SP7 Mouse mAb, Product Ab351396. Product datasheet. [Manufacturer's documentation; consult current datasheet for validated dilutions and lot-specific data.]

产品仅供科研与开发使用，不用于人体、动物、诊断或治疗。

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Da — 若无特别说明，分子量单位默认为道尔顿。 Mw — 重均分子量。 Mn — 数均分子量。