氯 化 钙（CaCl2) (2mol/L)

溶 解 14. 7 g CaCl2 于 IOOml H2O 中。过滤除菌或高压灭菌。

转染的细胞系： 293T 和 D17 (ATCC)

甘 油（1 0 % 〜2 0 % ) (合适的）

H ank 平衡盐溶液（HBSS)

2 X H E P E 缓 冲 液（HBS: 280m m ol/LN aCl、 1 0 m m o l/L K C l 、 1.5Imnol/LNa2 H P 0 4< ! > 、 12m m ol/L 葡萄糖、 50m m ol/LH EPES， pH 7.5)

LacZ 染 色 试 剂（Chemicon)

培养基

完全培养基： D M E M 培养基含 1 0 % 胎牛血清 F C S (293T 细胞）或 F B S (D 17细胞）、 1 % 青-I S 霉素、 1 % 谷氨酸

无血清培养基，含 1 % 青链霉素、 1 % 谷氨酸

磷酸盐缓冲液（P B S ) (合适的,•若操作甘油休克则需要）

无核酸酶水

用于生成反转录病毒的质粒

编码病毒包被蛋白的质粒

含有目的基因的基因转移载体

编码 E n v 蛋白的质粒

基于 SNV 和 REV-A 的病毒被表达特异性针对人类细胞表面受体的靶向配体的 VSV-G或其他 Env 包被蛋白假型。用作转染的质粒 DNA 的质量对于生成高滴度的反转录病毒载体是至关重要的。它应该是超纯的，应避免任何化学污染物， RNA 或蛋白质。我们建议用于反转录病毒颗粒生成的纯化的 DNA 的 A2m :A28。值大于 1. 8。

聚凝胺

Transfenctam 试 剂（P r o m e g a ) (合适的）

仪器

细胞培养皿 [ I O O m m (或采用利于多次转染的 12 孔 或 2 4 孔板）和 6 孔板]

离 心 管（15m l )

滤器：乙酸或聚磺酸纤维素（结合小分子蛋白质）， 〇.45um 滤膜

孵箱，预设到 37°C

小 离 心 管（1.5m l ，灭菌的）

显微镜

移 液 管（1.0m l 或巴斯德吸管）

摇床

超速离心机（B e c k m a n )， S W 41 转头

方法

细胞的准备

1.转染前 24 h，用完全培养基种植 293T 或 D 17 细胞在 IOOmm 平板中，过夜生长。种植 密 度 决 定 于 细 胞 的 增 殖 能 力 。一 般 来 说 ， IOOmm 的 平 板 种 植 0.5 X IO⁶ 〜0.8X 10⁶。

2.观察细胞密度， ‘汇合度应为 7 5 % 〜8 0 % 。用 I O m l 新鲜的完全培养基替换原培养基。孵 育 4 —— 6 h 。

细胞汇合度在获得最佳的病毒滴度中起主要作用。

转染

此方法适用于 IOOmm 细胞培养板。 D N A 的转染量应随着用于转染的培养板的大
小而变化。试 剂（CaCl2、 2 X H E P E 缓冲液、无核酸酶水）可以自制或购买（如 Prom e g a 的 ProFection M a m m a l i a n Transfection S y s t e m- C a P O 4)

3.对每个 I O O m m 平板，向已灭菌的 I.5m l 小离心管中加人 0 •5m l 2 X H E P E S 缓冲液，标记为管 1。

对于多个转染，用 12 或 2 4 孔板来准备转染混合物更简单。

4.另一管标记为管 2 , 加 人 IOug G a g -P o l 包被质粒， 4〜 5 啤 E nv ( V S V G 或 S N V 野生型）包被质粒和 1 〇鸿转染载体。质粒 D N A 的总量不应超过 30 ug 。 加 人 62ul 2m ol/LCaCl2 和足量的无核酸酶水，使总体积达到〇 . 5 m l。

5 . 用 I. O m l 移液管或巴斯德吸管将管 2 中的混合物逐滴加人管 1 中并用力吸打。或者在加人管 2 的过程中振荡管 1。最终溶液将生成沉淀，沉淀呈乳白色。
6 . 室温下放置混合物 2 0 〜 30m in 。

7.用吸液管上下吹打或振荡使沉淀混合均匀。

8 . 加 I m l 悬液和 5m l 无血清培养基到含 2 9 3 T 或 D 1 7 细胞的平板中。逐滴缓慢地加人混合悬液并轻柔漩涡。

9.37°C 孵 育 4〜6 h 。用 含 l 〇%F C S 的新鲜培养基替换原培养基。孵 育 36〜40 h 使产生重组病毒。

甘 油 休 克（合适的）

一些实验室在这一步进行甘油休克，以增加细胞核对导人 D N A 的吸收。在我们基
于 S N V 反转录病毒微粒生成的实验中，用甘油休克处理细胞与否没有很大的区别。

10•若选择甘油休克，则如下操作：

a•吸去培养基，用 5 ml PB S 或培养基洗两次。在清洗过程中摇晃平板并在显微镜
下观察，以确保大部分沉淀物被移去。若还有很多沉淀则重复清洗。

b. 加 入 2m l 已确定浓度的甘油到细胞中， 2〜4 min。
甘油的百分比在 10%〜2 0 % , 应根据经验决定。通常情况下，若对细胞的增殖能力无影响，则使用较高百分比的甘油。

c•弃去甘油， PB S 清洗，加 IO m l 新鲜培养基。

反转录病毒载体上清的收集

11.对于基于 SN V 载体生成的病毒，在 更 换 培 养 基 36〜4 0 h 后 ，收 集 转 染 的 293T 或D 17 细胞的上清液。将 其 至 于 15mi 离 心 管 中 ， 1500r/m in 离 心 5 min，弃去细胞碎片。

12•转移上清。立即用于滴度测定或_ 8 0 °C 冷冻直至需要用于转染。对 于 基 于 S N V 和R E V - A 的载体系统而言，用生物学滴度来衡量病毒的产量。上清要注意避免多次冻融，因为这样会导致反转录病毒滴度的严重减少。

反转录病毒微粒的浓缩

13.通 过 〇.45um 的滤膜过滤反转录病毒载体上清液。

不要用消化纤维滤膜，因为蛋白质会与滤膜结合，从而毁坏病毒膜表面。

14.H Bekman 超速离心机 SW4 转头 ， 4℃ ， 25 000r/m in 离 心 2 h 上清液。

15.缓慢地弃去上清，不搅动沉淀。用 50f J H B S S 重悬含反转录病毒微粒的沉淀。

16•确定浓缩的反转录病毒的滴度，详见下部分所描述，或一 80-C 冻存至下次应用。

由于冻融明显的减少滴度，特别是对 S N V , 所以最好现用现制。

确定反转录病毒的转导效率

此 流 程 需 要 或 其 他 报 道 基 因 整 合 到 转 移 载 体 中 。

17•确定反转录病毒滴度方法如下：

对于贴壁细胞
a•种植耙细胞 D17 (用 于 确 定 S N V 野生型包被假型的滴度）或 2 9 3 T , 完全培养基 ，密度小于 IXIO⁶个/IOOmm 平皿。生长 24 h。

b . 弃去培养基，加 I m l 病 毒 载 体 上 清 液 ，其 中 包 含 反 转 录 病 毒 微 粒 和 浓 度 为lO ug/m l 的聚凝胺。

或者，使用 Transfectam 试剂，浓度为 2ug/ml。 据观察， Transfectam 试剂比聚凝胺毒性小。

c. 3〜5 h 后（根据细胞类型），用 I O m l 新鲜培养基替换含有病毒的培养基。继续培养细胞 48 h 。
病毒感染细胞 5〜6 h 后为半剂量转染。过夜则为最大剂量转染。

d. 若有 诸 如 报 道 基 因 的 存 在 ，则 由 IacZ 试剂染色并计数蓝色细胞，从而以克隆形成单位（cfu) /m l 表示滴度。

若采用的是其他报道基因，则 可 采 取 免 疫 细 胞 化 学 或 实 时 聚 合 酶 链 反 应（PCR) 的方法，来精确检测基因表达和病毒滴度。

对 于 非 贴 壁 细 胞 的 转 导（悬 浮 细 胞）

a•转染前于 6 孔板中种植靶细胞 12〜18 h , 密度为 1.5X 10⁶ 个/m l 培养基。

b. 离心悬液中的细胞。在 聚 凝 胺（8ug/m l ) 或 Transfectam (2ug/m l ) 存在的情况下，在 病 毒 载 体 悬 液 中 以 1.5X 106 个/m l 的密度重悬细胞。如 前 所 述 ，T r a n s f e c t a m 由于毒性较小，是较好的选择。

c. 若采用聚凝胺作为转染试剂，则观察它对于细胞增殖和生长的作用是必需的，
因为悬浮细胞相对于贴壁细胞而言，其毒性效应更敏感一些。在振荡器上摇晃
平板。对 SNV，要产生最佳的转染效率，则聚凝胺的浓度在 8〜SOug/ml。

d. 4〜5 h 后离心弃去病毒微粒，完全培养基孵育 48 h ，如贴壁细胞所述。

e. 为了进一步增加效率，起始转染 12〜24 h 后可进行多次转染。

f. 固定并计数转染的细胞，确 定 cfu/m l 。

采 用 基 于 S N V 的反转录病毒微粒转导有丝分裂后的神经元细胞

此方法用于转移 Z a c Z 报道基因到有丝分裂后的分化的神经元细胞。

a. 根据先前由 M u k h t a r 等所描述的程序准备有丝分裂后的分化的神经元细胞。

b. 用 反 转 录 病 毒 微 粒 悬 液 和 T r a n s f e c t a m 试 剂（2ug/m l ) 混合覆盖细胞。放置 2 h 。

c. 重复反转录病毒微粒覆盖程序 3 次，间隔 24 h

d. 通过互补技术，确定这些有丝分裂后细胞中报道基因或治疗基因的表达。

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