实验介绍消减杂交，本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。

操作方法

消减杂交实验

材料与仪器

稀释缓冲液 杂交缓冲储存液 基三乙基溴化铵 矿物油 核酸和寡核苷酸
热循环仪

步骤

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

稀释缓冲液（20 mmol/L HEPES>HCl、pH8.3，50 mmol/LNaCl,0.2 mmol/L EDTA)

4X 杂交缓冲储存液：4mol/L NaCl,200 mmol/L HEPES、pH8.3,4 mmol/L 十六烷

基三乙基溴化铵（CTAB)。最终的 1X 杂交缓冲液，用稀释缓冲液稀释。

矿物油

2. 核酸和寡核苷酸

连接 Ad1 的检测者 1-1(方案 1 第 4 阶段第 8 步）

连接 Ad2R 的检测者 1-2(方案 1 第 4 阶段第 8 步）

驱动 DNA(方案 1 第 3 阶段第 5 步）

Rsa I 消化的驱动 DNA(方案 1 第 3 阶段第 5 步）

3. 专用设备

两台热循环仪（见第 11 步和第 12 步）

二、方法

1. 第一次杂交

（1）按照下面的顺序，将每个检测者样品与试剂混合。

（2）用 1 滴矿物油覆盖样品，并短暂离心。

（3）将样品在热循环仪中 98°C 温育 1.5 min。

（4）根据样品类型，按照下面列出的时间将样品在 68°C 温育，然后立即进入第二次杂交。

本方案使用 15ng 连接的检测 DNA 和 450ng 驱动 DNAa 如果得要不同的消减效率，可以改变驱动者和

检测者的比例。

2. 第二次杂交

（9）（原文无 5~8 步—译者注）对每个实验的驱动 DNA, 重复下面步骤。

将下面的试剂，加至灭菌的 0.5 ml(原文为 1ul。一译者改）离心管中。

（10）从混合物中取 1ul, 加至 0.5 ml 离心管中，并加 1 滴矿物油覆盖。

（11）在热循环仪中 98°C 温育 1.5 min。

（12）将刚刚变性的驱动者离心管取出，立即放入另一台已稳定在 68°C 的热循环仪中。
使用另一台热循环仪（或另一个 block) 可以确保样品的迅速降温。

（13）然后，按照同样的顺序，依次加入已杂交的样品 1-1 和 1-2(来自第一次杂交）。
这样确保在刚变性的驱动 DNA 过董的情况下，两个杂交样品漫合。

（14）将杂交反应液在 68°C 温育过夜。

（15）加入 100ul 稀释缓冲液，并吹吸混匀。

（16）在热循环仪中 72°C 温育 7 min。

（17）在-20°C 保存杂交反应液。

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