端粒酶是一种能够以自身 RNA 为模板合成端粒 DNA 的反转录酶，通常认为，端粒酶由蛋白部分以及 RNA 部分构成，RNA 部分（telomerase RNA，简写成 TR 或 TERC）是端粒合成的模板，其蛋白部分至少包括两个亚基，大亚基为端粒酶反转录酶（telomerasereverse transcriptase，TERT），其内部具有底物--端粒的结合位点，dNTP 结合的催化位点以及模板排列的位点。小亚基蛋白由 dyskerin（DKC1）及其他在 TR 处理过程中与装配成具有活性的端粒酶相关 H＋ACA 盒成员等小的核仁复合物组成，端粒酶催化端粒合成的示意图如图 11-7 所示。由于 TR 和 TERT 是端粒酶的活性基团，因此端粒酶的活性示与检测通常是通过检测 TR 及 TERT 的活性实现的，对于 TR 表达水平的检测通常可以采用定量 PCR 等方法，但由于 TR 实际上并非端粒酶活性的限速因子，因而检测端粒酶活性的研究主要针对检测 TERT 的活性而设计。传统上 TERT 的活性大致可以通过 3 种方法进行测定：即 PCR 技术、原位杂交技术、免疫荧光／免疫组化／免疫印迹技术。目前，用于端粒酶活性检测实验的方法主要有 1 种：TRAP 检测法。

原理

TRAP 检测法检测端粒酶活性的基本原理是通过具有活性的端粒酶催化，将端粒重复序列（GGTTAG）加到一个寡核苷酸底物 TS 的 3＇末端，然后通过 PCR 扩增 30～33 个循环，通过在反应中的 TS 引物上引入放射性同位素 y-32P-ATP 标记，对 PCR 产物采用聚丙烯酰胺电泳检测，最后采用放射性自显影检测并分析扩增结果。

另外也可以不对引物进行放射性同位素标记，而是采用非放射性的 SYBRGreen 染料对 PCR 产物进行染色鉴定，分析并量化出端粒酶的活性。

操作方法

TRAP检测法检测端粒酶活性

原理

TRAP 检测法检测端粒酶活性的基本原理是通过具有活性的端粒酶催化，将端粒重复序列（GGTTAG）加到一个寡核苷酸底物 TS 的 3＇末端，然后通过 PCR 扩增 30～33 个循环，通过在反应中的 TS 引物上引入放射性同位素 y-32P-ATP 标记，对 PCR 产物采用聚丙烯酰胺电泳检测，最后采用放射性自显影检测并分析扩增结果。另外也可以不对引物进行放射性同位素标记，而是采用非放射性的 SYBRGreen 染料对 PCR 产物进行染色鉴定，分析并量化出端粒酶的活性。

材料与仪器

器材：
① 组织研磨器
② 紫外分光光度仪
③ PCR 仪
④ 垂直电泳槽
⑤ 紫外凝胶成像系统
⑥ 待测细胞或组织样品细胞。
试剂：
① 聚丙烯酰胺凝胶试剂
② Taq DNA 聚合酶;
③ dNTP Mix。
④ SYBR Green 染料
⑤ TRAP 检测法引物（包括 TS引物，RP引物，K1引物，TSK1引物）;
⑥ 1x CHAPS 缓冲液（10 mmol/L Tris-HCI，pH7.5，1 mmol/L MgCl
2，
1 mmol/L EGTA，0.1 mmol/L 苯甲脒，5 mmol/L β-巯基乙醇，0.5％ CHAPS，10％ 丙三醇）
⑦ 10x TRAP 反应缓冲液（200 mmol/L Tris-HCI（pH8.3），15 mmol/L MgCl
2
，630 mmol/L KCI，0.5% Tween-20，10 mmol/L EGTA）

步骤

TRAP 检测法检测端粒酶活性的基本过程可分为如下几步：

B TRAP 反应设置，在每个反应中加入模板 2 μl，10x TRAP 反应缓冲液 5 μl，50x dNTP Mix 1 μl，TS引物 1 μl，TRAP 检测法引物（含 RP引物，K1引物，TSK1引物）1 μl，Taq DNA 聚合酶（5 U/μl）0.4 μl，ddH₂O 39.6 μl。

C PCR 扩增，PCR 反应条件为：30 ℃ 孵育 30 min，然后进行两步 30 个循环，包括 94 ℃ 变性 30 s，59 ℃ 退火／延伸混合 30 s。反应实际是一个共同缓冲液，双酶系统的反应，在第一个酶系统的反应中，端粒酶将一定数量的端粒重复序列（GGTTAG）转到了寡核苷酸底物 TS 的 3＇末端，而在第二个酶系统的反应中，TS 和 RP引物则可以扩增出一个以 6 碱基递增的产物梯度，如从 50 个核酸开始的：50，56，62，68•••••片段。

D 反应产物电泳及显色反应，将 PCR 反应产物上样到 10％ 聚丙烯酰胺凝胶中，1x TBE 缓冲液电泳，1:10000 SYBR Green 对凝胶进行染色 15 min 后拍摄照片。

注意事项

1 1x CHAPS 缓冲液裂解细胞应在冰上进行，组织样品比较难于裂解，可能需要用到电动匀浆器，注意应在冰上研磨，避免温度过高，离心应采用冷冻离心机以防止端粒酶遇热降解。

2 采用 SYBR Green 染色时间不应过长，染色应避光进行，拍摄时间不应过长，以防荧光染料见光分解，无法获得清晰图像。

如需了解更多产品详情，请前往阿拉丁官网查询。

https://www.aladdin-e.com