主要用于测定细胞能量代谢水平用以间接反映细胞增殖情况。

操作方法

MTT法

原理

活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490  nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。

材料与仪器

细胞
D-Hanks液 牛血清 RPMI1640 双抗 0.08%胰酶
净化工作台 离心机 恒温水浴箱 冰箱 倒置相差显微镜 培养箱 吸管 玻璃瓶 培养瓶 废液缸 吸头 枪头 胶塞 离心管 量加样枪 红血球计数板

步骤

一、接种细胞

1.  用0.08%胰蛋白酶消化单层培养细胞。

2.  用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液。

3.  以每孔10³～10⁴个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200 ul。
二、培养细胞

1.  将培养板移入CO₂孵箱中。

2.  在37℃、5% CO₂及饱和湿度条件下培养。（培养时间取决于实验目的和要求）
三、呈色

1.  每孔加入MTT溶液（5 mg/ml）20 ul，37℃孵箱中继续孵育4 h。

2.  终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。

3.  对于悬浮生长的细胞，需离心（1000 rpm，5 min），然后弃去孔内培养液。

4.  每孔加入150 ul DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解。
四、比色

1.  选择490 nm 波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。

2.  以时间为横轴，光吸收值为终轴绘制细胞生长曲线。

注意事项

1.  选择适当的细胞接种浓度。在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间。

2.  避免血清干扰，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行试验。

3.  设空白对照，与试验平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔。最后比色时，以空白孔调零。

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