本实验是以蔗糖为底物, 利用一定浓度的蔗糖酶水解不同浓度的蔗糖所形成的产物( 葡萄糖和果糖) 的量来计算蔗糖酶的Km值。

操作方法

二硝基水杨酸法

原理

根据Michaelis-Menten 方程:可以得到Lineweaver-Burk 双倒数值线方程:在 1/ V 纵轴上的截距是1/ Vmax , 在1/ [ S ] 横轴上的截距是- 1/ Km 。测定Km 和Vmax , 特别是测定Km , 是酶学研究的基本内容之一, Km 是酶的一个基本的特性常数, 它包含着酶与底物结合和解离的性质, 特别是同一种酶能够作用于几种不同的底物时,米氏常数Km 往往可以反映出酶与各种底物的亲和力强弱, Km值越大, 说明酶与底物的亲和力越弱, 反之, Km 值越小, 酶与底物的亲和力越强。双倒数作图法应用最广泛, 其优点是: ① 可以精确地测定Km 和Vmax ; ② 根据是否偏离线性很容易看出反应是否违反Michaelis-Menten 动力学; ③ 可以较容易地分析各种抑制剂的影响。此作法的缺点是实验点不均匀, V 小时误差很大。建议采用一种新的Eisenthal 直线作图法, 即将Michaelis-Menten 方程改变为:作图时, 在纵轴和横轴上截取每对实验值: V1 ～ [ S ] 1 ;V2 ～ [ S ]2 ; V3 ～ [ S] 3 ; ----连接诸二截点, 得多条直线相交于一点, 由此点即可得Km 和Vmax 。此作图法的优点是: ① 不用作双倒数计算; ② 很容易识别出那些不正确的测定结果。还可以用Hanes 方程进行作图, 斜率是1/ Vmax , 截距分别是-Km 和Km/ Vma x :

材料与仪器

蔗糖
乙酸缓冲液 葡萄糖 果糖 蔗糖 二硝基水杨酸溶液
分光光度计 水浴锅 试管 保鲜膜

步骤

1.  本实验和下一个实验均采用二硝基水杨酸法测量反应产物还原糖, 为了掌握该法测定的范围, 可先作一条标准曲线。按下表进行实验操作:

2.  按下面的表2测定不同底物浓度对催化速度的影响。

为使Km 测准, 必须先加蔗糖, 精确移液, 准确计时, 每隔30 秒钟或1 分钟加酶一次, 加酶后要摇动一下试管,每支试管 都要保证准确反应5 min , 然后加1.0 ml 二硝基水杨酸试剂, 立即用保鲜膜盖住管口, 绕上橡皮筋, 用针刺一小孔, 几根试管用一根橡皮筋套住放入沸水浴, 煮5 min 后取出放入冷水中速冷。最后加3.0 ml H2O, 充分摇匀, 必要时可用一小块保鲜膜盖住管口, 反复倒转试管, 混匀。用比色杯测定时, 空白对照管溶液必须充分摇匀, 彻底除去气泡, 测A520 值时要检查参比杯内壁上是否有气泡, 若有, 须倒回原试管, 再摇动除去残余气泡。实验中不允许用嘴吸试剂。实验完毕后要注意洗手。

3.  第9、10 二管先加中止反应的NaOH 溶液, 后加酶, 以保证加酶后不再产生任何还原糖, 用以校正蔗糖试剂本身的水解和酸水解。用第9、第10 二管的数据画一直线, 求出其他各管的校正数据, 对所测各管的A520 值进行校正, 然后计算每管的[ S ] , 1/ [ S] , V 和1/ V。

4.  画出反应速度V 与底物浓度[ S ] 的关系图(米氏曲线)和1/ V-1/ [ S ] 双倒数关系图(不要直接用A520 值作图) , 计算 Km 和Vmax , 并与文献值进行比较。实验结果记录时, 要将[ S ] 和V 的单位表示清楚, 并列出反应速度的计算公式。

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