组织单细胞制备是连接原始样本状态与下游流式分选、单细胞转录组、空间验证及功能实验的关键方法学环节。组织离体后的缺血应激、机械剪切、酶解强度、细胞碎裂、核酸泄漏和细胞群体偏倚，均可能在制备阶段被放大，并最终表现为活率下降、双细胞率升高、应激转录伪影增强及细胞组成失真。因此，单细胞制备中的样本处理与质量控制，应被视为决定样本可解释性、重复性和结果可信度的基础方法体系。

        关键词：单细胞制备；组织处理；样本质控；酶解；细胞活率；双细胞；去团聚；死细胞去除；单细胞转录组；流式分选

1. 组织单细胞制备的研究目标与方法学边界

1.1 单细胞制备的目标不是“尽可能多取细胞”

（1）高回收率不等于高质量输入

        在组织单细胞制备中，单纯追求细胞总数往往会掩盖方法学缺陷。若通过过强机械剪切或过度酶解获得更高回收率，但同时引入大量碎片、死细胞和应激伪影，则下游分析所得结果未必更具生物学价值。真正高质量的单细胞输入，应表现为合理回收率、较高活率、较低聚团率和较低背景污染的综合平衡。

（2）不同下游用途决定不同的制备优先级

        若下游目标为单细胞转录组，最优先控制的通常是活率、RNA完整性和解离诱导基因表达；若目标为流式分选，则需优先保护表面抗原和细胞膜完整性；若目标为原代培养或功能实验，则更强调细胞活性、代谢完整性和机械损伤最小化。因此，组织单细胞制备不存在脱离应用场景的统一最佳方案。

1.2 单细胞制备具有明确的方法学边界

（1）并非所有组织都适合直接制备高质量单细胞悬液

        高度纤维化组织、脂质含量极高组织、坏死成分丰富样本以及长期冻存后活率显著下降的组织，往往难以通过常规酶解直接获得高质量单细胞悬液。在这类情况下，单核制备、富集特定细胞群体、先行去杂或采用低温酶解，常比强行提高单细胞产量更具有方法学合理性。

（2）前处理条件决定后续数据解释边界

        组织一旦经历过长时间离体、反复冻融、粗暴吹打或过度酶解，即便后续建库成功，数据层面仍可能存在难以消除的技术偏差。因此，组织单细胞研究的首要原则不是先完成制备，而是确保制备流程本身不成为主要变量。

2. 组织样本接收与预处理阶段的控制要点

2.1 离体后时间控制是首个关键变量

（1）组织离体时间越长，伪影累积风险越高

        组织离体后会迅速发生缺血、缺氧和代谢重编程，部分细胞群体对这种变化极为敏感。若离体至处理之间间隔过长，可能在酶解前已出现凋亡增加、膜完整性下降和转录应激启动。此类变化并不来源于疾病本身，而来源于取材与接收流程，因此必须在方法学上尽可能压缩时间窗口。

（2）样本接收标准应包含时间记录与状态记录

        正式研究中，不宜只记录样本编号和来源，还应记录取材时间、进入保存液时间、开始剪碎时间和开始酶解时间。同时，应记录样本中是否存在凝血、坏死、脂肪过多、明显纤维化或机械压损。这些因素均可成为后续样本质控分层的重要依据。

2.2 运输与暂存条件直接影响细胞状态

（1）低温保存有利于延缓代谢崩解，但不等于无限延长可用时间

        多数组织样本在短时间运输中适合置于低温保存液中，以降低代谢速率和细胞死亡速度。但低温只能延缓变化，并不能逆转离体损伤。因此，低温运输应服务于尽快处理，而不是被误解为可较长时间搁置。

（2）保存液组成应兼顾渗透压、离子平衡和蛋白保护

        组织暂存液不应仅以生理盐水替代。更合理的样本保存体系应兼顾渗透压稳定、缓冲能力、基础离子平衡及必要时的蛋白保护环境，以减少细胞膜脆弱化和组织表面干燥损伤。

3. 组织解离前的机械预处理策略

3.1 机械剪碎的作用不是替代酶解，而是提高酶解均一性

（1）组织块尺寸直接决定后续消化是否均匀

        若组织块过大，酶液难以均匀进入内部，容易导致局部消化不足；若剪碎过度，则会引入细胞机械破裂和大量碎片。更合理的做法是将组织剪至相对均一的小块，以提高酶解接触面积，同时避免过度剪切。

（2）不同组织类型对机械预处理强度的耐受性不同

        淋巴组织、肿瘤组织、肝组织与纤维化组织的机械脆性和细胞外基质强度差异明显。富基质组织往往需要更充分剪碎，而高脆性组织则更应降低剪切强度。机械预处理应服从组织性质，而不应使用固定操作强度。

3.2 去除无效成分有助于提高后续制备质量

（1）明显坏死区和凝血块应在酶解前尽量剔除

        坏死区域和凝血成分不仅贡献低质量细胞，还会释放大量背景核酸、蛋白和碎片，增加样本黏滞度与过滤负担。因此，在不影响研究代表性的前提下，适当剔除明显无效组织可提升整体制备质量。

（2）脂肪成分过多样本应预先进行结构分离

        脂肪样组织常带来漂浮杂质、黏附问题和细胞计数误差。对高脂样本，预先分离明显脂肪团块，常有助于提高后续酶解均一性和清洗效率。

4. 酶解步骤中的参数控制与偏差来源

4.1 酶种选择应围绕组织成分与目标细胞类型设计

（1）胶原酶、分散酶和DNase I是最常见的核心组合

        富含细胞外基质的组织通常需要胶原酶类酶种破坏胶原与基质网络；分散酶更有利于温和拆解细胞连接；DNase I则用于降低死细胞破裂后DNA释放所造成的黏稠与团聚。不同酶种的组合并非机械叠加，而应根据组织结构和目标细胞保留需求进行优化。

（2）酶解强度过高会改变细胞群体代表性

        过度酶解不仅会损伤膜表面抗原，还会优先破坏对机械与酶学应激更敏感的细胞群体，导致下游数据中某些细胞亚群被低估。因此，酶解条件的优化目标不应只是组织完全散开，而应是在可接受回收率下尽量维持细胞组成真实度。

4.2 温度、时间和混匀节律是决定质量的关键变量

（1）过长消化时间会累积应激伪影

        酶解时间过长时，细胞不仅面临外基质解除，还会面临膜蛋白降解、能量耗竭和解离诱导转录反应。部分应激基因的上调并不代表组织真实生物学状态，而是制备过程本身的产物。因此，酶解时间应通过预实验控制在满足组织解离的最短窗口内。

（2）混匀节律应服务于均匀接触而非加速破碎

        轻柔颠倒混匀有助于酶液均匀接触组织块，但频繁剧烈吹打会显著增加细胞破裂和团聚背景。酶解过程中的机械扰动不应被当作加速解离的主要手段，而应被视为辅助均一化工具。

4.3 终止酶解的时机与方式同样影响后续质量

（1）酶解终点应以悬液质量而非肉眼完全消失判断

        若以组织块完全消失作为终点，往往意味着细胞已处于过度暴露状态。更合理的判断标准是：细胞悬液已形成、剩余组织块有限且后续轻柔处理可完成分散，同时活率与膜完整性仍在可接受范围内。

（2）停酶后应尽快进入低温清洗与过滤流程

        酶解一旦完成，若样本继续停留在室温或酶液环境中，膜损伤和背景污染仍会持续增加。停酶后应尽快进行低温稀释、过滤、洗涤和离心，以终止持续损伤。

5. 去团聚、去死细胞与去碎片处理的质量控制价值

5.1 团聚控制决定单细胞制备是否真正成立

（1）团聚会直接提高双细胞率和建库噪音

        组织酶解后形成的细胞团聚，来源于DNA泄漏、局部基质残留、膜破裂和未充分分散的细胞连接。若团聚未被有效控制，下游建库中将显著增加双细胞事件，导致假性共表达、细胞类型混杂和聚类误判。

（2）去团聚不应以强吹打为主要方式

        过度吹打虽然可暂时减少大团块，却会同步提高碎片和死细胞比例。更合理的策略通常是优化DNase I使用、增加适度过滤和改善酶解均一性，而不是在终末阶段依赖强力机械分散。

5.2 死细胞去除决定背景污染水平

（1）死细胞不仅降低活率，还会释放背景RNA

        在单细胞转录组实验中，死细胞释放的大量游离RNA可造成环境RNA污染，进而导致低表达假阳性和细胞类型信号串扰。因此，死细胞比例高并不只是影响样本外观，而是直接影响表达矩阵质量。

（2）死细胞去除应考虑样本损失与群体偏倚

        磁珠法、密度梯度法或染料分选法均可用于去死细胞，但这些处理也可能造成样本总量下降或特定脆弱细胞群进一步流失。因此，死细胞去除应在降低背景与保留代表性之间取得平衡。

5.3 碎片控制是提升测序有效性的必要环节

（1）高碎片背景会干扰计数、分选与建库

        碎片过多不仅影响细胞计数准确性，还会在流式门控中增加噪音，在微液滴建库中提高无效捕获比例。对于高坏死、富脂或高纤维组织，碎片控制的重要性并不低于活率控制。

（2）过滤与离心参数应避免碎片富集

        若滤网孔径过小、离心力过大或重复离心次数过多，可能将碎片与脆弱细胞共同沉降，从而恶化样本质量。因此，过滤与离心应以去除大团聚和重碎片为目的，而不应一味提高分离强度。

6. 上机前样本质量控制的核心指标体系

6.1 活率、浓度与聚团率是基础三指标

（1）活率决定可用细胞比例与背景风险

        活率过低时，不仅代表死细胞增多，也常提示环境RNA、蛋白释放和膜完整性破坏同步增强。活率并非唯一指标，但通常是判断样本是否具备上机条件的第一关口。

（2）浓度与聚团率共同影响捕获质量

        单细胞建库并不只依赖有多少细胞，还依赖细胞浓度是否适配平台要求，以及样本是否真正呈现单细胞分散状态。若浓度合适但聚团率高，则下游仍会出现显著双细胞问题。

6.2 细胞组成偏倚应纳入前分析质控

（1）某些细胞亚群的异常缺失可能源于制备而非生物学差异

        若某一类细胞在多个样本中系统性偏低，不能立即判定为疾病相关变化，也可能是酶解敏感性、机械脆弱性或富基质依赖造成的制备偏倚。因此，样本质控不应只看技术参数，还应看细胞群体分布是否符合组织学预期。

（2）组织来源差异需通过平行标准化流程控制

        来自不同部位、不同处理批次和不同病理状态的组织，其基质强度和脆弱性差异很大。若流程标准化不足，不同样本间的技术差异可能被误读为生物学差异。

6.3 RNA质量与应激背景应作为高级质控指标

（1）高质量单细胞样本不应伴随广泛的应激转录激活

        若样本中普遍存在即时早期基因、热休克基因和应激相关基因异常升高，往往提示解离伪影明显。这类样本即使活率尚可，也应警惕其在表达层面已偏离原始组织状态。

（2）线粒体转录比例升高常提示细胞损伤加重

        若大量细胞表现出线粒体转录占比异常升高，通常提示细胞膜完整性下降、胞质RNA丢失或细胞濒死状态增加。该指标虽不能单独判定样本优劣，但在转录组质控中具有较高提示价值。

7. 不同组织类型中的处理策略差异

7.1 免疫器官与肿瘤组织更强调温和解离与群体保留

（1）免疫器官样本更容易获得高回收，但更易受机械应激影响

        脾脏、淋巴结等组织通常基质较少，制备相对容易，但免疫细胞对剪切、温度变化和渗透压波动较敏感。因此，过强机械处理可能比酶解不足更早成为质量瓶颈。

（2）肿瘤组织应同时关注基质去除与肿瘤细胞保护

        实体瘤样本常伴随细胞外基质增多、坏死区和血液污染共存。此类样本制备需在足够解离与不过度损伤肿瘤细胞及免疫浸润细胞之间保持平衡。

7.2 富纤维化组织与脂肪组织更强调分层处理

（1）富纤维化组织不宜直接套用常规酶解时间

        纤维化肝组织、部分结缔组织和瘢痕样肿瘤组织往往需要更强基质处理，但这也会同步增加细胞损伤风险。对此类组织，更合理的策略通常是先优化机械剪碎和酶液渗透，而非单纯延长酶解时间。

（2）脂肪组织应重点控制漂浮层和脂滴污染

        脂肪成分过多时，悬液中会出现漂浮碎屑和脂滴污染，不仅影响计数和门控，也会降低样本均一性。因此，脂肪组织样本常需更充分的预分离和漂浮层去除。

表1 组织单细胞制备中的组织特异性解离体系及流程控制产品

表2 组织单细胞制备与质量控制中的基础通用试剂

8. 组织单细胞制备中的常见问题

8.1 常见问题

（1）将高细胞数误判为高质量样本

        若样本虽有较高细胞回收，但伴随高碎片、高死细胞和高应激背景，则其方法学质量并不理想。以总数作为首要评价标准，容易掩盖制备流程中的核心缺陷。

（2）将单次成功经验机械外推到所有组织

        不同组织在基质强度、细胞脆性、脂质含量和病理背景上存在本质差异。将某一组织的成功流程直接套用于其他组织，往往会造成系统性偏差。

        组织单细胞制备的核心难点，不在于将组织解离成悬液，而在于在尽可能保留真实细胞组成、分子状态与功能完整性的前提下，获得可重复、可建库、可解释的高质量输入。样本处理与质量控制因此不是单细胞研究的外围步骤，而是决定后续数据可靠性与结论边界的基础方法学体系。

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[2] 多种组织单细胞解离酶的应用与优化