试剂盒概述与原理

阿拉丁科学病毒DNA/RNA快速提取试剂盒（D1128032）专为从多种生物样本中快速、高效地分离病毒DNA和RNA而设计。该试剂盒采用硅胶膜离心柱格式，在离液盐条件下选择性结合核酸，通过一系列洗涤步骤去除蛋白质、脂质及其他杂质，最终用低盐缓冲液或无核酸酶水洗脱纯化的核酸。

离液裂解缓冲液在接触样本后可迅速灭活核酸酶（RNase和DNase），有效保护特别易降解的病毒RNA的完整性。简化的柱式操作流程无需使用苯酚、氯仿等有害有机溶剂，提高了实验室安全性和通量。所得洗脱液适用于多种高灵敏度下游应用，包括逆转录PCR（RT-PCR）、定量PCR（qPCR）、Sanger测序及二代测序（NGS）文库构建。

所需材料与仪器设备

试剂盒内含组分：

• 裂解/结合缓冲液（离液型，含盐酸胍盐）
• 洗涤缓冲液1（用于去除蛋白质和抑制物）
• 洗涤缓冲液2（乙醇基础；首次使用前请按瓶标说明加入无水乙醇）
• 洗脱缓冲液（低盐、无核酸酶）或无核酸酶水
• 硅胶膜离心柱
• 收集管（2 mL）
• 载体RNA（如有附带；使用前加入裂解缓冲液，以提高低拷贝病毒核酸的回收率）

需自备材料：

• 可达≥10,000 × g的微量离心机
• 涡旋混合仪
• 100%乙醇（分子生物学级）
• 无核酸酶1.5 mL微量离心管（用于洗脱液收集）
• 移液器及无核酸酶气溶胶屏障吸头
• 个人防护装备（手套、实验服、护目镜）
• 可选：加热模块或水浴锅（设定至56–70°C，用于增强裂解效果）

分步提取操作规程

操作前重要提示：确保洗涤缓冲液2已按瓶标说明补加所需体积的100%乙醇。如随盒提供载体RNA，请在裂解缓冲液中加入至推荐浓度配制工作液。将洗脱缓冲液预热至70°C以最大化核酸产量。处理含RNA样本时请在冰上操作，以减少降解。

1. 样本裂解：将推荐体积的裂解/结合缓冲液加入样本（如200 µL血清或血浆），涡旋混匀15秒。如规程要求，在56–70°C孵育10分钟，以确保彻底裂解和核酸酶灭活。
2. 加入乙醇：向裂解液中加入指定体积的100%乙醇，涡旋或吹打混匀，促进核酸与硅胶膜结合。
3. 上柱：将全部裂解液-乙醇混合液转移至置于2 mL收集管中的硅胶膜离心柱，以8,000–10,000 × g离心1分钟，弃去流穿液，将柱重新置于收集管中。若裂解液体积超过柱容量，可分批上样，每次离心后弃去流穿液。
4. 第一次洗涤：向柱中加入指定体积洗涤缓冲液1，以8,000–10,000 × g离心1分钟，弃去流穿液。
5. 第二次洗涤：向柱中加入指定体积已补加乙醇的洗涤缓冲液2，以8,000–10,000 × g离心1分钟，弃去流穿液。
6. 膜干燥：将空柱以最高转速（≥10,000 × g）再离心2分钟，去除残余乙醇，防止其抑制下游酶促反应。
7. 洗脱：将离心柱转移至新的、已标记的无核酸酶1.5 mL收集管，将预热的洗脱缓冲液（或无核酸酶水）直接加至膜中央，室温孵育1–3分钟，以8,000–10,000 × g离心1分钟，流穿液即为纯化的病毒DNA/RNA。如需提高产量，可再加一次洗脱缓冲液进行第二次洗脱。
8. 储存：洗脱液立即置于冰上供短期使用；长期储存时，RNA洗脱液置−70°C，DNA洗脱液置−20°C，避免反复冻融。

质量控制与下游验证

提取完成后，在进行下游应用前，请通过以下方法评估核酸的质量和浓度：

• 分光光度法分析：使用微量分光光度计（如NanoDrop）检测260 nm（A260）和280 nm（A280）处的吸光度。纯净RNA的A260/A280比值通常约为2.0，纯净DNA约为1.8，比值明显偏离此范围提示可能存在蛋白质或溶剂污染。同时检测A260/A230比值，以评估离液盐或有机溶剂残留，一般可接受值为≥1.8。
• 荧光定量法：对于低浓度或高度稀释的洗脱液，荧光定量分析（如Qubit RNA HS或DNA HS试剂盒）比分光光度法更灵敏、更准确。
• 功能验证：最可靠的质量检测方法是功能性下游实验。在裂解前加入已知拷贝数的外源RNA或DNA内对照，可评估提取效率并检测PCR抑制物。每次实验均应设置无模板阴性对照，条件允许时设置阳性提取对照。
• 凝胶电泳（可选）：如需评估RNA完整性，可在变性琼脂糖凝胶上电泳，或使用微流控毛细管电泳系统（如Agilent Bioanalyzer或TapeStation）观察核糖体RNA条带并获取RNA完整性指数（RIN）。对于来自无细胞样本（血清、血浆）的病毒RNA，通常不会出现明显的rRNA条带，可通过靶序列的成功扩增来间接判断病毒RNA的完整性。

常见问题排查

当实验结果不理想时，请参考下表进行排查：