Western 印迹技术即蛋白质免疫印迹技术

原理

Western 印迹技术检测蛋白质实验的基本原理是将经聚丙烯酰胺凝胶分离的蛋白转移至硝酸纤维膜，然后将膜片与特异的抗体作用，抗体与膜片上的蛋白的条带结合后可被进一步检测到，如用酶标的二抗或生物素标记的二抗进行作用，可再以发色底物显色。

操作方法

蛋白质免疫印迹

原理

Western 印迹技术检测蛋白质实验的基本原理是将经聚丙烯酰胺凝胶分离的蛋白转移至硝酸纤维膜，然后将膜片与特异的抗体作用，抗体与膜片上的蛋白的条带结合后可被进一步检测到，如用酶标的二抗或生物素标记的二抗进行作用，可再以发色底物显色。

材料与仪器

器材：
硝酸纤维薄膜、Whatman 3 MM 滤纸、电转移仪。
试剂：
① 一抗
② 二抗
③ 羊血清
④ ECL 显影试剂盒
⑤ 转移缓冲液
（12 gTris 碱、57.65 g 甘氨酸加甲醇溶解后，最后加水定容至 1 L，调 pH 至 8.3）。
⑥ TTBS 10 mmol/L Tris (pH8.3), 150 mmol/L NaCl, 0.05% Tween-20。
⑦ 0.5% 丽春红 S 染料溶液
（丽春红 S0.5 g，冰醋酸 1 ml，溶解后加水定容至 100 ml，用前配制。）
⑧ 封闭缓冲液
（脱脂奶粉 10 g；TTBS 70 ml；充分溶解后定容至 100 ml，加入 10% 叠氮化钠 200 μl（终浓度为 0.02%），4 ℃ 保存）。
⑨ DAB 显色液
（0.01 mol/L TBS（pH7.6）9 ml；DAB，6 mg；3 g/L NiCl2 或 CoCl2， 1 ml；滤纸过滤后加入 10 μl 30% H2O2，混匀后立即使用）。

步骤

Western 印迹技术检测蛋白质实验的基本过程可分为如下几步： （一）提取蛋白质 A 将培养细胞用 PBS 洗 1 次。 B 0.025% 胰酶消化细胞至细胞呈疏松状态，倒掉胰酶。 C PBS 吹打细胞，收集于离心管。 D 转入 Eppendorf 管内，用 PBS 洗 1 次。 E 加入 100 μl 细胞裂解液，打匀。 F 冰浴 20 min。 G 13000 r/min 离心 5 min。 H 吸上清液，加等量上样缓冲液。 I 煮沸变性 5 min，- 20 ℃ 保存。 （二）电泳 A 灌胶 将电泳玻璃板安置于电泳槽上，灌制 8% 分离胶 15 ml，分离胶上以 5 ml 正丁醇或 0.1% SDS 覆盖；待胶凝固后，倒去覆盖物，细胞总蛋白提取物用去离子水冲洗凝胶上部；将成层胶 8 ml 灌注于分离胶上，插入梳子。 B 上样 1 ml 上样缓冲液加入 9 μl 巯基乙醇；待测样品与上样缓冲液以 1:2 混合，100 ℃ 煮沸 5 min；成层胶凝固后拔出梳子，电泳缓冲液冲洗梳空；将蛋白质分子质量标准参照物和样品上样。 C 电泳 样品侧接负极，电流 10 mA，样品进入分离胶后，电流加大到 20 mA，电泳 4～6 h 左右，直到染料达分离胶底部。 （三）转膜 A 将凝胶拆下，左上角切下做标记，凝胶、PVDF 膜、滤纸在转膜缓冲液中平衡 30 min。 B 安装转膜装置（图 8-4）如下。C 接通电源，恒流状态，按膜大小选择电流，≤ 0.8 mA/c㎡，转膜 6 h。 D 取出 PVDF 膜，左上角剪切口做标记，TTBS 洗膜 5 min，3 次，除去 Tris 及甘氨酸。 E 丽春红 S 染色 5 min，水脱色 2 min，可以看到膜上的电泳条带，据蛋白质分子质量标准参照物，在与所测蛋白肌动蛋白相应分子质量中间将膜剪为上下两半，再脱色 10 min，使其完全褪色。 F 把膜放入可热封的塑料袋，按滤膜面积加入封闭液，0.1 ml/c㎡，密封，4 ℃ 过夜。 （四）抗体反应 A 过夜后的膜，TTBS 洗膜 10 min，3 次。 B 分别加入用封闭液稀释的一抗，抗体稀释倍数为 1:200～1:2000（视抗体的效价的高低而定），25 ℃ 平缓摇动孵育 1 h。 C TTBS 洗膜 10 min，3 次。 D 将膜转入另一热封的塑料袋中，加入二抗工作液（1:1000），0.1 ml/c㎡，25 ℃，摇动孵育 45 min。 E TTBS 洗膜 10 min，3 次。 F ECL 试剂盒显影。

注意事项

Western 印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感性，即使低至 1～5 ng 的蛋白质也可被检测到。转膜时应注意硝酸纤维薄膜和 3 MM 滤纸事先要用转移缓冲液湿润，膜与滤纸都不要用手直接拿，因为皮肤上的油脂和分泌物会阻止蛋白质从凝胶向膜转移。滤纸和膜的大小须裁减得与胶一样大小，如果滤纸或膜面积大于凝胶，滤纸和膜的边缘有可能相接触而引起短路。膜片与一抗和二抗作用后，要用缓冲液冲洗干净。根据蛋白质的分子量不同，可选用不同的转膜装置，而转膜时间则随转膜装置的不同而异，如使用一种半干式碳板转移电泳槽，150 mA 只需转移 2 h 左右。

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