谷胱甘肽是机体内源合成的一种三肽抗氧化剂，在保护体内蛋白质和DNA免受自由基及氧化应激损伤方面具有十分关键的作用。此外，这一多功能小分子及其结合蛋白在生物技术研究领域也被广泛用于多种实验用途。

         谷胱甘肽由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸三种氨基酸构成，属于三肽分子，主要功能是维持细胞内的氧化还原稳态并参与多种解毒过程。除其固有的生理角色之外，谷胱甘肽在科学研究中还具备多种重要应用，例如蛋白质纯化、蛋白质复性以及细胞培养等。

         本文将围绕谷胱甘肽在细胞内的主要功能、其不同分子形式，以及它在科学研究中的具体应用进行介绍与讨论。

图1.还原型谷胱甘肽（γ-L-Glu-L-Cys-Gly）的结构。三种氨基酸残基采用不同颜色标示：谷氨酸（粉色）、半胱氨酸（橙色）和甘氨酸（绿色）。谷氨酸侧链的γ-羧基与半胱氨酸的氨基通过γ-肽键相连。

为什么谷胱甘肽如此重要？

         谷胱甘肽对生命至关重要。实验研究表明，若小鼠缺乏合成谷胱甘肽的能力，其个体在出生前就会死亡；同样，如果在出生后阻断其谷胱甘肽合成，小鼠通常会在约一个月内死亡（Ashley，2018）。这些结果清楚地表明，谷胱甘肽对于哺乳动物的正常发育和机体稳态维持均不可或缺。

         那么，谷胱甘肽到底重要在哪里呢？可以把谷胱甘肽想象成细胞内部的“害虫防治系统”。它可以清除和中和各种小分子活性物质，否则这些物质会攻击并损伤细胞赖以生存的蛋白质和核酸。这些“害虫”包括多种氧化剂和有毒金属离子。下一节中，我们将进一步介绍这类分子，以及谷胱甘肽是如何与它们结合并实现解毒的。

         此外，谷胱甘肽还是多种酶（如谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽-S-转移酶）的重要辅因子（Marí 等，2009）。所谓辅因子，是指酶在催化化学反应时必需的分子。与在反应中被消耗的反应物和生成的产物不同，辅因子在反应前后基本保持不变，因此可以反复参与催化过程。这些依赖谷胱甘肽的酶同样具有清除氧化性分子的功能，因此谷胱甘肽既能直接中和氧化剂，又能通过酶促反应间接发挥抗氧化作用，可谓“双重打击”。

         大多数健康人能够在体内合成充足的谷胱甘肽。然而，对于部分人群——例如具有谷胱甘肽合成酶突变的患者，以及艾滋病和囊性纤维化患者——补充谷胱甘肽可能带来一定益处（Ashley，2018）。

         到这里，我们已经概括了谷胱甘肽的许多关键功能。那么，从分子层面来看，谷胱甘肽究竟是一种怎样的物质呢？

谷胱甘肽的不同形式

         谷胱甘肽可以以多种相关形式存在，不同形式往往适用于不同的实验场景，因此了解这些差异非常重要。

         图1所示为还原型谷胱甘肽。在氧化还原化学中，可以将“还原态”简单理解为分子把电子“握在自己手里”的状态，而“氧化态”则是这些电子被拿去与其他原子共享、参与成键的状态。对于谷胱甘肽来说，这一变化主要发生在半胱氨酸残基的硫原子上：在还原态中，硫原子以游离巯基（–SH）的形式存在，将电子保留在自身，而不是用来与其他原子形成键（见图 2）。

图2.还原型谷胱甘肽的结构示意图，用点标出硫原子的孤对电子。之所以称其为还原型谷胱甘肽，是因为硫原子将这些电子保留在巯基中，并未与其他原子共享形成共价键。

         氧化型则相反，是指半胱氨酸利用这些电子与其他分子形成共价键的状态。谷胱甘肽正是通过这种方式与氧化剂和有毒金属发生反应。因此，在生物体内，半胱氨酸的一种氧化形式，就是它与金属离子或其他细胞内氧化剂结合的状态（见图 3）。

图3.氧化型谷胱甘肽与砷（紫色）结合的结构示意图。砷是一种人体致癌物（Rubino，2015）。谷胱甘肽通过与砷结合，帮助中和并将其从细胞中清除，从而在其损伤其他生物大分子之前将其排除。

         当我们谈到市售的氧化型谷胱甘肽时，一般指的是其二聚体形式，即两分子谷胱甘肽通过各自半胱氨酸上的硫原子相互成键连接在一起（见图 4）。

图4.氧化型谷胱甘肽二聚体的结构示意图，其中一分子谷胱甘肽与另一分子谷胱甘肽共价连接。

         这种形式上的区别听起来似乎很细微，但在实际应用中却非常关键。在下一节将要介绍的部分应用中，必须根据实验需求选用还原型或氧化型谷胱甘肽这一正确形式。

         最后一种需要介绍的形式是谷胱甘肽还原型乙酯（glutathione reduced ethyl ester）。与前面提到的两种形式相比，这一衍生物的细胞摄取效率显著更高。因此，在向细胞或动物体内补充谷胱甘肽时，谷胱甘肽还原型乙酯通常是更合适的选择。进入细胞后，内源性酶会迅速将其转化为还原型谷胱甘肽（Levy 等，1993）。

谷胱甘肽的科研应用

谷胱甘肽被广泛应用于多种科研实验中，包括：

(1) 蛋白纯化

(2) 蛋白复性

(3) 细胞培养

(1) 蛋白纯化

         谷胱甘肽S-转移酶（Glutathione S-transferase，GST）是一种常用的蛋白溶解标签。通过将GST与目标蛋白融合表达，可形成GST融合蛋白，从而提高目标蛋白的溶解性，减少沉淀发生。

由于GST能够特异性结合谷胱甘肽，这一相互作用被广泛用于亲和纯化。具体做法是先将GST融合蛋白结合到谷胱甘肽琼脂糖填料上，在洗去其他杂蛋白后，再加入还原型谷胱甘肽，将GST融合蛋白从填料上洗脱下来。

(2) 蛋白复性

         在蛋白纯化过程中，缓冲液中通常会加入还原剂，以防止许多蛋白形成非天然的二硫键并发生聚集。二硫键是半胱氨酸侧链上两个硫原子之间形成的共价键，氧化型谷胱甘肽就是一个典型例子（见图4）。

         常用的还原剂包括TCEP、DTT和βME。这些还原剂还原能力较强，能够有效抑制二硫键的形成。

         相比之下，谷胱甘肽作为还原剂则更“温和”一些——具体含义如下。谷胱甘肽通常用于这样一种情形：希望蛋白能够在多种潜在的二硫键组合之间进行“采样”，从而最终选择能量上最有利的二硫键排布（Lundström-Ljung & Holmgren，1995）。

         举例来说，在重组蛋白的表达和纯化过程中，蛋白有可能形成一种在其天然环境下并不会出现的二硫键。此时，如果加入一定比例的还原型和氧化型谷胱甘肽混合物，蛋白就可以在不同的二硫键状态之间反复转换；若其天然构象在热力学上更稳定，蛋白最终就有较大概率回到这种“正确”的天然二硫键形式（见图 5）。

         这里所说的“能量上更有利”在严格意义上是指该状态具有更低（更负）的吉布斯自由能，这通常意味着蛋白结构更加紧凑，并在内部形成更多相互作用，类似于图5右侧示意的那种折叠状态。通过这种方式，谷胱甘肽有助于确保纯化后的蛋白处于正确的构象。

图5.左侧的蛋白代表异源表达过程中形成的一种动力学陷阱构象：由于在翻译过程中第一和第二个半胱氨酸最先暴露，它们优先彼此形成二硫键。通过加入还原型与氧化型谷胱甘肽的混合物，可以促使该非天然二硫键重新排列，使蛋白逐步复性为右侧所示的构象——此时蛋白更为紧凑、在能量上更有利，二硫键则形成在第一和第三个半胱氨酸残基之间。

(3) 细胞培养

         谷胱甘肽在维持培养细胞的氧化还原稳态方面发挥着重要作用，许多常用的细胞培养基配方中已经预先添加了谷胱甘肽（Ishii & Mann，2014）。不过，在某些实验条件下，仍然有必要额外补充谷胱甘肽，例如：为原本不含谷胱甘肽的培养基添加谷胱甘肽；提高已含谷胱甘肽培养基中的谷胱甘肽浓度；或对长期使用的“老”培养基进行补充，以弥补其中谷胱甘肽随时间被氧化消耗的部分。

         如前文所述，在细胞培养应用中，谷胱甘肽还原型乙酯通常是更理想的选择，因为与其他形式相比，它具有显著更高的细胞摄取效率（Levy 等，1993）。

         谷胱甘肽远不只是一个小小的三肽分子，它同时是生命活动和科研实验中不可或缺的工具。无论你是在研究氧化还原生物学、优化蛋白折叠过程，还是提升细胞培养体系的表现，深入理解谷胱甘肽都会大有裨益。

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参考文献

[1] Ashley RD. Ask the Doctors – What do glutathione supplements do? UCLA Health News, 2018-07-10.

[2] Marí M, Morales A, Colell A, García-Ruiz C, Fernández-Checa JC. Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant［线粒体谷胱甘肽：关键的生存型抗氧化剂］. Antioxid Redox Signal, 2009, 11(11): 2685–2700. doi:10.1089/ars.2009.2695.

[3] Rubino FM. Toxicity of glutathione-binding metals: a review of targets and mechanisms［谷胱甘肽结合金属的毒性：靶点与机制综述］. Toxics, 2015, 3(1): 20–62. doi:10.3390/toxics3010020.

[4] Levy EJ, Anderson ME, Meister A. Transport of glutathione diethyl ester into human cells［谷胱甘肽二乙酯进入人细胞的转运研究］. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993, 90(19): 9171–9175.

[5] Lundström-Ljung J, Holmgren A. Glutaredoxin accelerates glutathione-dependent folding of reduced ribonuclease A together with protein disulfide-isomerase［谷胱甘肽依赖性还原型核糖核酸酶A折叠过程中，谷氧还蛋白与蛋白二硫键异构酶的协同作用］. J Biol Chem, 1995, 270(14): 7822–7828.

[6] Ishii T, Mann GE. Redox status in mammalian cells and stem cells during culture in vitro: Critical roles of Nrf2 and cystine transporter activity in the maintenance of redox balance［体外培养条件下哺乳动物细胞及干细胞的氧化还原状态：Nrf2及半胱氨酸/胱氨酸转运活性在维持红氧平衡中的关键作用］. Redox Biol, 2014, 2: 786–794.

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