MeloScript Ⅱ Reverse Transcriptase是通过体外分子进化技术对野生型MMLV逆转录酶进行多位点突变获得的新一代逆转录酶。相较于野生型MMLV逆转录酶，MeloScript Ⅱ Reverse Transcriptase更适配一步法RT-qPCR，极大降低对Taq DNA聚合酶的抑制作用，对于常见的干扰物有一定的耐受性。
MeloScript Ⅱ Reverse Transcriptase 的反应温度为50-60℃，这一特性对于处理高GC含量的模板尤其有利。高温条件下，RNA双链更容易解旋，减少了二级结构形成的概率，进而提高了逆转录效率和准确性。
组分表
FP1508911 | 组分 | 20KU | 200KU | 2000KU | 储存温度 |
FP1508911A | MeloScript Ⅱ Reverse Transcriptase (200U/μL) | 100 μL | 1.0 mL | 10 mL | -20℃ |
FP1508911B | 5×MeloScript buffer | 1.0 mL | 10×1.0 mL | 100 mL | -20℃ |
适用范围
1. 主要应用于一步法 Real Time RT-PCR
单位定义
以 Poly(rA)·Oligo(dT)为模板/引物，在 37℃，10min条件下，掺入 1 nmol 的 dTTP 为酸不溶性物质所需要的酶量定义为 1个活性单位(U)。
注意事项
1. RNase 污染控制
请保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证 RNase-free。
2. 引物设计（基因特异性引物（GSP ））
2.1 引物 3'端最后一个碱基最好为 G 或者 C；
2.2 引物 3'端最后 8 个碱基应避免出现连续错配；
2.3 引物 3'端应避免出现发夹结构；
2.4 正向引物和反向引物的 Tm 值相差不超过 1℃为佳，Tm 值调整至 55 ~ 65℃为佳(引物 Tm 值推荐使用 Primer Premier 5进行计算)；
2.5 引物额外附加序列，即与模板非配对序列，不应参与引物 Tm值计算；
2.6 引物的 GC 含量控制在 40% - 60%之间；
2.7 引物 A、G、C、T 整体分布要尽量均匀，避免使用 GC 或者 AT 含量高的区域；
2.8 引物内部或者两条引物之间避免有 5 个碱基以上的互补序列，两条引物的 3'端避免有 3 个碱基以上的互补序列；引物设计完毕请使用 NCBI BLAST 功能检索引物特异性，以避免非特异性扩增产生。
其他注意事项
1. 酶量控制
在进行 One-Step RT-qPCR 反应时，过高的逆转录酶量容易导致非特异性的 PCR 产物，导致扩增曲线平台期荧光信号下降。
2. 酶的使用
在使用 MeloScript Ⅱ Reverse Transcriptase 时，避免反复剧烈震荡，且需放置于冰盒内。
使用方法
1. 反应体系配制
1.1.室温/4℃溶解并混匀反应所需的各种溶液。并放置于冰浴上或冰盒内。
1.2. 参考下表设置荧光定量 PCR 反应体系,建议荧光定量 PCR
反应体系的配制在冰浴或在冰盒上进行：
组分
| 加入体积
| 终浓度
|
5× MeloScript Buffer
| 5μl
| 1×
|
dNTP（25mM each）
| 0.2μl
| 0.2mM
|
Forward Primer（10 uM）
| 0.5μl
| 0.2µM
|
Reverse Primer（10 uM）
| 0.5μl
| 0.2µM
|
Probe（10 uM）
| 0.25μl
| 0.1µM
|
RNase Inhibitor (40 U/μl)
| 0.25μl
| 0.4U/μl
|
MeloScript Ⅱ Reverse Transcriptase（200U/μl）
| 0.2μl
| 1.6U/μl
|
PowerResist Taq Polymerase
（5U/μL）
| 0.5μl
| 0.1U/μl
|
Template
| 5μl
| / |
Nuclease-free H2O
| To 25μl
| /
|
终体积
| 25μl
| /
|
1.3 反应体系中各成分的量可根据以下原则自行调整：
1) 一般来说反应体系中引物终浓度为 0.2µM，即可得到较好的扩增效果。当反应性能比较差时，可以在 0.1 - 1.0µM 范围内调整引物浓度。
2) 探针终浓度可以在 50 - 250 nM 之间调整。
3) qPCR 灵敏度极高, 建立反应体系时加入模板量的准确程度对最终定量结果会有很大的影响。推荐将模板稀释后(如稀释至 2 - 5μL /样本)加入反应体系中，这样可以有效提高实验的重复性。
4) 扩增产物长度请选择在 80 - 200 bp 范围内。
反应程序
步骤名称
| 温度
| 时间 | 循环 |
逆转录
| 50℃
| 15min
| 1 |
预变性
| 95℃
| 2min30s
| 1 |
变性
| 95℃
| 15s
| 35-40 |
退火+延伸
| 55℃
| 20s
| 35-40
|
1.对于具有复杂二级结构或高 GC 区域的模板，将逆转录温度提高到 55℃，有助于提高扩增效率和灵敏度。
2.如需支撑快速程序，可将逆转录酶反应时间缩短至 5min。
3.延伸时间请根据您使用的 Real Time PCR 仪所需要的数据采集最短时间限制自行调整：使用 ABI 7700 和 7900HT 时至少 30 sec；使用ABI 7000和7300时至少31 sec；使用ABI 7500时至少34 sec。
4.实际使用的 Real Time PCR 仪是否支持快速扩增循环，初次尝试请进行预实验确认。
MeloScript Ⅱ Reverse Transcriptase is a next-generation reverse transcriptase obtained through in vitro molecular evolution technology with multiple site-directed mutations of wild-type MMLV reverse transcriptase. Compared to wild-type MMLV reverse transcriptase, MeloScript Ⅱ shows better compatibility with one-step RT-qPCR, significantly reducing inhibition of Taq DNA polymerase while maintaining tolerance to common reaction inhibitors.
The optimal reaction temperature for MeloScript Ⅱ Reverse Transcriptase is 50-60℃, making it particularly advantageous for processing high-GC templates. At higher temperatures, RNA duplexes unwind more easily, reducing secondary structure formation and thereby improving reverse transcription efficiency and accuracy.
Product Component List
FP1508911 | Components | 20KU | 200KU | 2000KU | Storage |
FP1508911A | MeloScript Reverse Transcriptase (200U/μL) | 100 μL | 1.0 mL | 10 mL | -20℃ |
FP1508911B | 5×MeloScript buffer | 1.0 mL | 10×1.0 mL | 100 mL | -20℃ |
Applications
- Primarily used for one-step Real-Time RT-PCR
Unit Definition
One unit (U) is defined as the amount of enzyme required to incorporate 1 nmol of dTTP into acid-insoluble material in 10 minutes at 37℃ using poly(rA)·oligo(dT) as template/primer.
Precautions
1. RNase Contamination Control
Maintain a clean working area
Wear clean gloves and masks during operation
Ensure all consumables (centrifuge tubes, pipette tips) are RNase-free
2. Primer Design (Gene-Specific Primers, GSP)
2.1 The 3'-end base should preferably be G or C
2.2 Avoid ≥2 consecutive mismatches in the last 8 bases at the 3'-end
2.3 Avoid hairpin structures at the 3'-end
2.4 Optimal Tm difference between forward and reverse primers should be ≤1℃, with Tm preferably adjusted to 55-65℃ (calculate using Primer Premier 5)
2.5 Additional non-templated sequences should not be included in Tm calculations
2.6 Maintain primer GC content between 40%-60%
2.7 Ensure even distribution of A, G, C, and T bases; avoid regions with extreme GC or AT content
2.8 Avoid >5 bp complementary sequences within primers or between primer pairs; avoid ≥3 bp complementarity at 3'-ends between primers. Verify primer specificity using NCBI BLAST to prevent nonspecific amplification
Additional Notes
1. Enzyme Amount Control
Excessive reverse transcriptase in one-step RT-qPCR reactions may lead to nonspecific PCR products, resulting in decreased fluorescence signals during the plateau phase.
2. Enzyme Handling
Protocol
1. Reaction System Preparation
1.1 Thaw and mix all required reagents at room temperature/4℃. Keep on ice or in an ice box.
1.2 Prepare the Real-Time PCR reaction system according to the table below (recommended to prepare on ice):
Component
| Volume
| Final Concentration
|
5× MeloScript Buffer
| 5μl
| 1×
|
dNTP (25mM each)
| 0.2μl
| 0.2mM
|
Forward Primer (10 uM)
| 0.5μl
| 0.2µM
|
Reverse Primer (10 uM)
| 0.5μl
| 0.2µM
|
Probe (10 uM)
| 0.25μl
| 0.1µM
|
RNase Inhibitor (40 U/μl)
| 0.25μl
| 0.4U/μl
|
MeloScript Ⅱ Reverse Transcriptase (200U/μl)
| 0.2μl
| 1.6U/μl
|
PowerResist Taq Polymerase (5U/μL)
| 0.5μl
| 0.1U/μl
|
Template
| 5μl
| / |
Nuclease-free H2O
| To 25μl
| /
|
| Total | 25μl
| /
|
1.3 Reaction components can be adjusted according to the following principles:
Generally, a final primer concentration of 0.2 μM yields good amplification. If performance is poor, adjust within 0.1-1.0 μM.
Probe concentration can be adjusted between 50-250 nM.
Due to qPCR's high sensitivity, accurate template addition significantly impacts quantification results. We recommend diluting templates (e.g., to 2-5 μL/sample) before adding to reactions to improve reproducibility.
Optimal amplicon length: 80-200 bp.
Reaction Program
Step
| Temperature
| Time
| Cycles
|
Reverse Transcription
| 50℃
| 15min
| 1 |
Initial Denaturation
| 95℃
| 2min30s
| 1 |
Denaturation
| 95℃
| 15s
| 35-40 |
Annealing/Extension
| 55℃
| 20s
| 35-40 |
Notes:
For templates with complex secondary structures or high GC content, increasing reverse transcription temperature to 55℃ improves amplification efficiency and sensitivity.
For rapid protocols, reverse transcription time can be reduced to 5 min.
Adjust extension time according to your Real-Time PCR instrument's minimum data acquisition requirements:
Verify instrument compatibility with rapid cycling protocols through preliminary experiments.
ZJ26F0333683
危险品化学品经营许可证（带存储）