MeloScript Reverse Transcriptase是通过体外分子进化技术获得的全新逆转录酶。该逆转录酶能有效抵御RNA提取后残留的多种抑制剂，包括异丙醇，Lysis buffer等，使实验不再受限于样本质量，提升了实验的广泛适用性和成功率。同时，凭借其卓越的底物特异性和高效催化能力，该酶能够精准识别并逆转录目标RNA序列，包括低丰度、高GC含量及具有复杂二级结构的区域，显著提高了靶标的捕获率和后续实验的灵敏度。
组分表
FP1509103 | 组分 | 20KU | 200KU | 2000KU | Storage |
FP1509103A | MeloScript Reverse Transcriptase (200U/μL) | 100 μL | 1.0 mL | 10 mL | -20℃ |
FP1509103B | 5×MeloScript buffer | 1.0 mL | 10×1.0 mL | 100 mL | -20℃ |
适用范围
1.主要应用于一步法 Real Time RT-PCR
2. First-Strand cDNA 的合成
单位定义
以 Poly(rA)·Oligo(dT)为模板/引物，在37℃，10min条件下，掺入1 nmol 的 dTTP 为酸不溶性物质所需要的酶量定义为1个活性单位(U)。
注意事项
1. RNase 污染控制
请保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证 RNase-free。
2. 引物选择
2.1 反转录产物用于 PCR：
1) 如果模板为真核生物来源，一般情况下首选 Oligo dT，与真核生物 mRNA 的 3' Poly A 尾配对，可获得最高产量的全长 cDNA。
2) 基因特异性引物（GSP）的特异性最高。但有些情况下，用于PCR 反应的 GSP 无法有效引导第一链 cDNA 合成。这时可改用 Oligo dT 或 Random hexamers 重新进行逆转录。
3) Random hexamers 特异性最低，所有 RNA，包括 mRNA，rRNA，tRNA 均可以作为 Random hexamers 的模板。当目标区域具有复杂二级结构或 GC 含量较高，或者模板为原核生物来源，使用OligodT 或 GSP 无法有效引导 cDNA 合成时，可使用 Random hexamers 为引物。
2.2 反转录产物用于 qPCR：
1) 将 Oligo dT 与 Random hexamers 混合使用，可使 mRNA各个区域 cDNA 合成效率相同，有助于提高定量结果的真实性和重复性。
2) 特定场景下可使用基因特异性引物（GSP）做 One-Step 或Two-Step RT-qPCR。
3. 引物设计（基因特异性引物（GSP ））
3.1 引物 3'端最后一个碱基最好为 G 或者 C；
3.2 引物 3'端最后 8 个碱基应避免出现连续错配；
3.3 引物 3'端应避免出现发夹结构；
3.4 正向引物和反向引物的 Tm 值相差不超过 1℃为佳，Tm 值调整至 55 ~ 65℃为佳(引物 Tm 值推荐使用 Primer Premier 5 进行计算)；
3.5 引物额外附加序列，即与模板非配对序列，不应参与引物 Tm值计算；
3.6 引物的 GC 含量控制在 40% - 60%之间；
3.7 引物 A、G、C、T 整体分布要尽量均匀，避免使用 GC 或者AT 含量高的区域；
3.8 引物内部或者两条引物之间避免有 5 个碱基以上的互补序列，两条引物的 3'端避免有 3 个碱基以上的互补序列；引物设计完毕请使用 NCBI BLAST 功能检索引物特异性，以避免非特异性扩增产生。
其他注意事项
1. 酶量控制
在进行 One-Step RT-qPCR 反应时，过高的逆转录酶量容易导致非特异性的 PCR 产物，导致扩增曲线平台期荧光信号下降。
2. 酶的使用
在使用 MeloScript Reverse Transcriptase 时，避免反复剧烈震荡，且需放置于冰盒内。
使用方法
1. 反应体系配制
1.1.室温/4℃溶解并混匀反应所需的各种溶液。并放置于冰浴上或冰盒内。
1.2. 参考下表设置荧光定量 PCR 反应体系,建议荧光定量 PCR
反应体系的配制在冰浴或在冰盒上进行：
组分
| 加入体积
| 终浓度
|
5× MeloScript Buffer
| 5μl
| 1×
|
dNTP（25mM each）
| 0.2μl
| 0.2mM
|
Forward Primer（10 uM）
| 0.5μl
| 0.2µM
|
Reverse Primer（10 uM）
| 0.5μl
| 0.2µM
|
Probe（10 uM）
| 0.25μl
| 0.1µM
|
RNase Inhibitor (40 U/μl)
| 0.25μl
| 0.4U/μl
|
MeloScript Reverse Transcriptase（200U/μl）
| 0.2μl
| 1.6U/μl
|
PowerResist Taq Polymerase
（5U/μL）
| 0.5μl
| 0.1U/μl
|
Template
| 5μl
| / |
Nuclease-free H2O
| To 25μl
| /
|
终体积
| 25μl
| /
|
1.3 反应体系中各成分的量可根据以下原则自行调整：
1)一般来说反应体系中引物终浓度为 0.2µM，即可得到较好的扩增效果。当反应性能比较差时，可以在 0.1 - 1.0µM 范围内调整引物浓度。
2)探针终浓度可以在 50 - 250 nM 之间调整。
3) qPCR 灵敏度极高, 建立反应体系时加入模板量的准确程度对最终定量结果会有很大的影响。推荐将模板稀释后(如稀释至 2 - 5 μl /样本)加入反应体系中，这样可以有效提高实验的重复性。
4)扩增产物长度请选择在 80 - 200 bp 范围内。
反应程序
步骤名称
| 温度
| 时间 | 循环 |
逆转录
| 50℃
| 15min
| 1 |
预变性
| 95℃
| 2min30s
| 1 |
变性
| 95℃
| 15s
| 35-40 |
退火+延伸
| 55℃
| 20s
| 35-40
|
1. 对于具有复杂二级结构或高 GC 区域的模板，将逆转录温度提高到 55℃，有助于提高扩增效率和灵敏度。
2. 如需支撑快速程序，可将逆转录酶反应时间缩短至 5min。
3. 延伸时间请根据您使用的 Real Time PCR 仪所需要的数据采集最短时间限制自行调整：使用ABI 7700和7900HT时至少30 sec；使用 ABI 7000 和 7300 时至少 31 sec；使用 ABI 7500 时至少 34sec。
4. 实际使用的 Real Time PCR 仪是否支持快速扩增循环，初次尝试请进行预实验确认。
MeloScript Reverse Transcriptase is a novel engineered enzyme developed through in vitro molecular evolution technology. It demonstrates exceptional resistance to common inhibitors (e.g., isopropanol, lysis buffers) present in RNA extracts, enabling reliable performance with suboptimal samples. With superior substrate specificity and catalytic efficiency, it achieves:
✔ High-fidelity reverse transcription of challenging templates (low-abundance, high-GC, or structured RNAs)
✔ Enhanced target capture rate and downstream assay sensitivity
Product Component List
FP1509103 | Components | 20KU | 200KU | 2000KU | Storage |
FP1509103A | MeloScript Reverse Transcriptase (200U/μL) | 100 μL | 1.0 mL | 10 mL | -20℃ |
FP1509103B | 5×MeloScript buffer | 1.0 mL | 10×1.0 mL | 100 mL | -20℃ |
Applications
One-Step Real-Time RT-PCR
First-strand cDNA synthesis
Unit Definition
One unit (U) is defined as the amount of enzyme required to incorporate 1 nmol of dTTP into acid-insoluble material in 10 min at 37°C using poly(rA)·oligo(dT) as template/primer.
Key Guidelines
1. RNase Control
• Maintain a clean workspace with RNase-free consumables (tubes, tips).
• Always wear gloves and masks during handling.
2. Primer Selection
2.1 PCR
• Eukaryotic RNA: Oligo dT (full-length cDNA)
• Prokaryotic RNA/structured regions: Random hexamers
• Target-specific: GSP (Gene-Specific Primer)
2.2 qPCR
• Oligo dT + Random hexamers (balanced coverage)
• GSP for One-/Two-Step RT-qPCR
3. GSP Design Rules
3'-end: Prefer G/C; avoid ≥2 consecutive mismatches or hairpins
Tm: 55–65°C (ΔTm ≤1°C between primers; calculate with Primer Premier 5)
GC content: 40–60% (uniform base distribution)
Specificity: Avoid >5 bp self-complementarity or 3' dimerization; verify with NCBI BLAST
Critical Notes
Enzyme Handling: Avoid vortexing; keep on ice during use.
Enzyme Amount: Excess RT enzyme causes nonspecific PCR products (reduced plateau fluorescence).
Protocol
I. Reaction Setup (25 μL System)
Component
| Volume
| Final Concentration
|
5× MeloScript Buffer
| 5μl
| 1×
|
dNTP (25mM each)
| 0.2μl
| 0.2mM
|
Forward Primer (10 uM)
| 0.5μl
| 0.2µM
|
Reverse Primer (10 uM)
| 0.5μl
| 0.2µM
|
Probe (10 uM)
| 0.25μl
| 0.1µM
|
RNase Inhibitor (40 U/μl)
| 0.25μl
| 0.4U/μl
|
MeloScript Reverse Transcriptase (200U/μl)
| 0.2μl
| 1.6U/μl
|
PowerResist Taq Polymerase (5U/μL)
| 0.5μl
| 0.1U/μl
|
Template
| 5μl
| / |
Nuclease-free H2O
| To 25μl
| /
|
| Total | 25μl
| /
|
Notes:
Primer/Probe Optimization: Adjust concentrations (0.1–1 μM primers; 50–250 nM probe)
Template Dilution: Dilute to 2–5 μL/sample for reproducibility
Amplicon Length: 80–200 bp (optimal for qPCR)
II. Thermal Cycling
Step
| Temperature
| Time
| Cycles
|
Reverse Transcription
| 50℃
| 15min
| 1 |
Initial Denaturation
| 95℃
| 2min30s
| 1 |
Denaturation
| 95℃
| 15s
| 35-40 |
Annealing/Extension
| 55℃
| 20s
| 35-40 |
Optimization Tips:
RT Temperature: Increase to 55°C for structured/high-GC templates
Fast Protocols: Reduce RT time to 5 min
Data Acquisition: Adjust extension time per instrument:
ABI 7700/7900HT: ≥30 sec
ABI 7000/7300: ≥31 sec
ABI 7500: ≥34 sec
ZJ26F0333718
危险品化学品经营许可证（带存储）