在核酸检测、宏基因组学和转录组学等应用中，测序平台与生物信息学流程往往不是误差的主要来源，真正决定数据可解释性和可重复性的，是从采集到保存这一整条“前分析链”。如何在样本离体后尽可能维持体内原始分子状态，是所有核酸相关实验和应用必须首先解决的工程问题。下面从样本类型、靶标分子（DNA/RNA）、保存体系设计到典型应用场景，对“样本采集与保护”进行系统梳理。

一、样本采集与前分析变量：核酸质量的“源头控制”

1.1 前分析变量对结果的放大效应

在核酸检测、宏基因组分析、转录组测序等实验中，前分析环节引入的微小误差，往往会在扩增、建库和数据分析过程中被非线性放大，最终表现为：测序深度浪费、样本间差异被噪声淹没，甚至获得错误的生物学结论。

影响核酸质量的关键前分析变量主要包括：

（1）采集时间与处理滞后：样本长时间置于室温会导致RNA快速降解、DNA剪切以及微生物组成偏移；

（2）温度与反复冻融：低温有助于抑制代谢和酶活性，但频繁冻融会加速核酸断裂并诱导脂质和蛋白质变性；

（3）化学环境：pH、螯合剂、盐浓度及防腐剂等共同决定DNase、RNase以及水解/氧化反应的速率；

（4）采集介质与容器：是否含抗凝剂、是否为RNase free、是否与下游提取体系兼容，直接影响核酸回收率和背景干扰水平。

1.2 核酸降解与偏倚的典型机制

（1）酶介导降解：血液、组织、粪便等样本中富含内源性DNase、RNase以及微生物来源的核酸酶，在室温条件下即可在数小时内显著降低核酸完整性；

（2）细胞破裂与自溶：采集和运输过程中渗透压变化、机械剪切以及温度应激可导致细胞破裂，释放蛋白酶和核酸酶，加速核酸降解并重塑分子组成；

（3）微生物组成迁移：在粪便、口腔、呼吸道样本中，离体环境改变会造成部分菌群快速增殖、另一些迅速死亡，群落结构发生“体外演化”，偏离真实体内状态。

1.3 样本类型决定保存策略

不同样本在物理化学特性、微生物负荷以及靶标核酸形态上存在显著差异：

唾液/拭子：宿主细胞量低，宿主核酸与微生物核酸共存，易受环境污染与干燥影响；

粪便：固体或半固体基质，微生物群高度复杂，伴随胆盐、多酚、多糖等多种PCR抑制物；

血液：细胞成分复杂，RNase含量高，RNA极易降解；

组织：代谢活跃，对剪切应力与渗透压变化高度敏感，易发生自溶与局部坏死；

纯化质粒或体外转录RNA：通常浓度高，但对氧化、冻融及痕量核酸酶极为敏感。

因此，科学的样本保护体系应基于样本类型与靶标分子特性设计专用保存液，而不是采用“一种缓冲液通用所有样本”的简单方案。

二、以DNA为主要靶标的样本采集与保存策略

2.1 唾液/拭子样本：基因组DNA的非侵入性来源

唾液及口腔/咽拭子已广泛应用于人群队列研究、遗传多态性分析、法医学鉴定和大规模筛查。相较血液样本，其优势包括：

（1）采集方式非侵入且操作简便，有利于提高受试者依从性，可在非医疗环境实施；

（2）适合邮寄与远程采集，为大规模队列和多中心研究提供可行路径。

针对这类样本的DNA保存体系通常需要实现：

（1）快速裂解上皮细胞并暴露宿主基因组DNA，同时抑制核酸酶活性；

（2）在室温下长期稳定（通常可达1–2年），降低对冷链运输的依赖；

（3）有效抑制细菌和真菌生长，降低背景信号并保障生物安全；

（4）与常用DNA提取方式（硅胶柱、磁珠等）和下游应用（SNP分型、芯片、NGS、qPCR等）高度兼容。

2.2 粪便样本：锁定原始肠道微生物群落结构

粪便是肠道微生物组分析与粪便DNA检测的核心样本类型，但其处理存在多重挑战：

（1）微生物活性高：离体后菌群结构在短时间内即可发生明显漂移；

（2）抑制物丰富：胆汁酸、多糖、多酚等内源性成分/基质成分对PCR与建库具有显著抑制效应；

（3）基质高度不均一：不同取样位置微生物组成存在本底差异。

粪便DNA保存液的典型设计思路包括：

（1）采用高效化学裂解体系，快速溶解样本基质并释放微生物DNA；

（2）同步抑制DNase、RNase和蛋白酶活性，维持核酸完整性；

（3）在室温条件下保持良好稳定性，便于现场采样与常温运输；

（4）尽可能“冻结”采集当时的菌群结构，减少体外增殖或死亡导致的丰度偏移。

2.3 质粒DNA：工程载体与标准模板的长期结构稳定

质粒DNA作为表达载体、标准曲线模板或阳性对照，其保存目标不仅在于数量上的损失最小化，更在于维持拓扑结构和功能稳定性：

超螺旋构象比例保持稳定，有利于转化和表达；

避免机械剪切和化学降解导致的片段化；

减少冻干和反复冻融引起的构象改变和活性下降。

质粒DNA保存体系通常采用“缓冲体系 + 稳定剂 + 金属螯合剂”的组合：

（1）通过适宜pH和离子强度维持DNA电荷状态与空间构象；

（2）螯合痕量金属离子，抑制金属依赖性核酸酶；

（3）适配-20℃或4℃长期储存，并保证在转化、转染或体外反应前可直接使用。

三、以RNA为主要靶标的样本采集与稳定化

3.1 细胞/组织样本：RNA表达谱的原位“时间封存”

RNA对RNase和环境应激高度敏感，采集后若不能快速处理或冻存，转录组信息会在短时间内不可逆损失。传统依赖液氮或干冰冷链的策略，在大规模临床样本和现场采集场景中实施成本高且易出错。

RNA专用保存液的核心设计原则包括：

（1）以化学方式快速渗入细胞，失活RNase，并终止转录、翻译等细胞活动；

（2）在4℃或室温下，可在一定时间窗口内（从数天到数周）保持mRNA和miRNA表达谱的相对稳定；

（3）可直接作为RNA提取的起始介质，减少离心、转移等高风险操作步骤。

该类体系适用于血细胞沉淀、培养细胞、组织匀浆等多种样本形态，尤其适合无法立即冻存的临床批量采样。

3.2 血液RNA：在常温条件下尽量逼近冷冻保存效果

外周血转录组可反映免疫状态和疾病相关表达模式，但整血中RNase极为丰富，且采血后细胞仍处于动态应答状态。若处理不当，短时间内表达谱即出现显著偏移。

血液RNA稳定保存体系通常目标在于：

（1）采血后立即与全血充分混匀，快速渗透血细胞并抑制RNase活性；

（2）阻断信号转导与转录过程，将采集时刻的转录组状态“锁定”；

（3）在室温或4℃条件下在一定时间窗口内维持RNA完整度和表达谱稳定。

该类体系非常适合大样本量队列、跨中心样本转运及野外或基层采血场景，可显著降低对冷链系统的依赖。

3.3 体外转录RNA：标准品和探针的高保真保存

体外转录RNA常用作：

定量检测中的标准曲线模板；

杂交探针和体外翻译反应的模板；

测序体系中的Spike-in内参和质控材料。

这类RNA通常高度纯化但缺乏天然保护因子，其主要风险在于：

（1）痕量RNase污染（如枪头、管壁或空气中的残留）；

（2）反复冻融导致链断裂、聚集及构象异常；

（3）氧化损伤与碱性水解引起的化学降解。

体外转录RNA保存体系一般应满足：

（1）严格的RNase free与低金属离子背景，尽可能降低酶促与化学降解风险；

（2）兼容-20℃、-80℃或液氮存储，减少冻结界面对RNA的物理损伤；

（3）使用后可直接进入反转录或杂交体系，不需要额外去除稳定剂。

四、病毒样本与DNA/RNA双重保护

4.1 病毒核酸的脆弱性与复杂基质挑战

呼吸道拭子、咽拭子以及其他临床标本中的病毒核酸常处于低拷贝水平，同时伴随大量宿主核酸、蛋白质和潜在PCR抑制物。采样至检测之间的延迟及温度波动，可显著影响病毒核酸的可检测性。

仅使用生理盐水或普通运输介质时，常见问题包括：

（1）病毒颗粒破裂后，RNA在RNase作用下迅速降解；

（2）反复冷冻和解冻造成包膜与衣壳损伤，诱导核酸剪切；

（3）细菌和真菌增殖，增加酶活性和代谢产物，进一步放大核酸降解和背景干扰。

4.2 通用型病毒样本DNA/RNA保存体系的特征

面向病毒检测的DNA/RNA保存体系通常需具备：

（1）同时适配DNA病毒与RNA病毒，兼容PCR/qPCR/RT-PCR以及高通量测序等检测方式；

（2）在室温下有效抑制核酸酶与微生物生长，满足基层采样点与常温运输需求；

（3）与柱式或磁珠式核酸抽提体系高度兼容，不引起沉淀、相分离或对裂解/结合/洗脱过程产生显著干扰。

这类体系在传染病监测、应急响应和大范围筛查中尤为重要，可在冷链能力有限的条件下维持病毒核酸的分析有效性。

五、组织与综合样本保存体系

5.1 组织保存液：在形态学和分子层面之间取得平衡

实体组织样本（如肿瘤、器官组织、活检块等）既用于常规病理学评价，又常用于DNA/RNA/蛋白多组学分析。理想的组织保存体系需要在形态与分子层面上取得平衡：

（1）在2–8℃短期保存条件下维持组织结构和细胞形态，减少自溶、坏死与结构解体；

（2）在-20℃长期保存时尽可能保持核酸和蛋白的完整性与可提取性；

（3）与组织消化、初代细胞培养、类器官构建以及后续核酸提取流程兼容，不显著抑制酶促反应或建库效率。

在类器官培养、病理伴随分子检测及组织多组学研究中，合理选择组织保存液，可以显著提高样本利用率与跨项目数据的可比性。

5.2 通用样品保存稳定剂：高异质样本场景中的“缓冲层”

在综合样本收集、初筛样本集中保存或跨实验室样本流转等场景下，样本类型高度异质且下游使用目的尚未完全确定，单一针对性的保存体系往往难以覆盖全部需求。此时更需要一种“通用型样品稳定层”，其主要作用包括：

（1）在较宽的pH和基质范围内抑制降解反应，延长样本可用时间窗口；

（2）减轻反复冻融、运输振荡及短时温度波动对样本质量的影响；

（3）为后续根据具体研究目的进行二次分装与针对性处理提供时间缓冲。

此类稳定剂适用于尚未明确下游分析路径但需要保障样本整体质量的收集与暂存场景，尤其适用于外送检测前的中转环节以及需要兼顾DNA/RNA/蛋白多向开发的设计。

六、典型应用场景中的体系组合思路

6.1 大规模人群队列与生物样本库构建

在大规模队列研究和生物样本库建设中，为获得长期可用、可重复开发的高质量核酸资源，可按样本类型构建分层次保存体系：

（1）口腔拭子/唾液：配置唾液/拭子DNA保存体系，以支持常温邮寄与集中处理；

（2）粪便：使用粪便DNA保存液锁定肠道微生物群落结构，用于16S测序和宏基因组学分析；

（3）全血：采用血液RNA稳定化体系采集转录组信息，并结合DNA提取策略实现双重用途；

（4）组织：采集后立即置入组织保存液，再根据项目需求选择冷冻、分子提取或细胞/类器官培养路径。

6.2 感染性疾病监测与多源标本整合

在病原学监测与暴发疫情调查中，往往需要并行获取和处理多类样本：

（1）咽拭子/鼻拭子：使用通用型病毒DNA/RNA保存体系，保障病原体核酸的稳定与可检测性；

（2）粪便：用于病原菌/肠道病毒的核酸检测与分型；

（3）血液：用于宿主免疫应答、细胞因子及外周血转录组分析。

通过针对性保存体系的组合应用，可以在不显著增加前端工作量的前提下，最大限度保留病原体信息与宿主反应信息，为病原–宿主互作研究提供高质量样本基底。

6.3 实验室内标与质控材料的标准化保存

实验室日常运行依赖大量质粒DNA、体外转录RNA以及不同水平的标准模板和内参材料：

（1）质粒DNA保存体系用于长期保存表达载体和阳性对照，保证其可转化性和序列完整性；

（2）体外转录RNA保存体系用于标准曲线制备、方法学性能评估与灵敏度/线性范围验证；

（3）通用样品稳定剂可作为混合质控样本的稳定载体，支持批量制备、分装与跨批次使用。

通过为各类关键分子资源配置匹配的保存策略，可以显著提升方法学的可重复性以及跨批次、跨平台数据的一致性。

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          样本采集与保护的本质，是在时间维度上尽可能精确地“冻结”采集时的生物学状态，使后续获得的核酸谱系尽量逼近体内真实情形。只有在采集瞬间就引入针对样本类型和靶标分子特性精细设计的保存体系，才能在后续的检测和分析中最大程度减少前分析偏倚。

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