本公司生产的一步法 sgRNA 合成试剂盒，即 One-Step sgRNA Synthesis Kit，是基于 CRISPR/Cas9 基因编辑技术而研发的 sgRNA (single guide RNA)体外转录合成试剂盒。使用本试剂盒，用户仅需按照本试剂盒说明书设计并合成 Target-specific DNA oligo，就可以通过本试剂盒每次一步反应获得 5-25μg sgRNA。获得的 sgRNA 可以用于体外分析和鉴定 sgRNA 的效果，也可以用于转染表达 Cas9 的细胞以实现目的基因的基因编辑。sgRNA，也称 gRNA，由 18-20bp 与靶基因序列互补的 CRISPR RNA (crRNA)序列以及能与 Cas9 特异性结合的 trans-activating crRNA (tracrRNA)序列组成。在细胞内，Cas9 核酸酶可以特异性地结合 sgRNA，同时 sgRNA 也能特异性地与相应的靶基因序列配对结合，这样就可以导致 Cas9 核酸酶在靶基因位点的 PAM (proto-spacer adjacent motif)序列 NGG 上游大约三个碱基的位置对靶基因进行切割。随后在细胞 DNA 修复过程中会导致基因靶位点处的插入、删除或替换，从而可能产生移码突变，导致目的基因的缺失突变。本公司生产的 One-Step sgRNA Synthesis Kit 可以通过一步反应高效产生靶向目的基因的 sgRNA。本试剂盒提供了 Cas9 Scaffold Oligo，该序列与使用者设计的 Target-specific DNA Oligo 部分互补，在 DNA 聚合酶的作用下延伸获得用于转录的 dsDNA 模板，然后使用本试剂盒提供的 RNA 聚合酶催化 sgRNA 合成，20µl 单管反应可在 0.5h-4h 内获得5-25μg 功能性的 sgRNA。纯化后的 sgRNA 可以转染细胞，在表达 Cas9 的细胞中进行基因编辑，也可以与 Cas9 核酸酶混合进行酶切鉴定实验。
组分和说明
| O1373182-CG20T | Component | 20T | 5*20T | Storage | | O1373182A | 2X sgRNA Reaction Mix | 200μl | 5*200μl | -20℃. Avoid freeze/thaw cycle. | | O1373182B | Enzyme Mix | 40μl | 5*40μl | -20℃. Avoid freeze/thaw cycle. | | O1373182C | RNase Inhibitor (40U/µl) | 20μl | 5*20μl | -20℃. Avoid freeze/thaw cycle. | | O1373182D | DNase I | 40μl | 5*40μl | -20℃. Avoid freeze/thaw cycle. | | O1373182E | Ultrapure Water | 400μl | 5*400μl | -20℃. Avoid freeze/thaw cycle. |
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产品应用
在细胞内，Cas9 核酸酶可以特异性地结合 sgRNA，同时 sgRNA 也能特异性地与相应的靶基因序列配对结合。
产品优势
操作便捷，应用广泛。
使用说明
1.sgRNA 合成。
a.参考下表在冰浴上设置 sgRNA 合成反应体系。如果同时进行多个 sgRNA 反应，可以把下表中除 Target-specific DNA Oligo 之外的所有组分提前预混合，然后分装到各反应管内，再在各管内加入 Target-specific DNA Oligo。
| Reagent | Volume | | Ultrapure Water | 6µl | | Target-specific DNA Oligo (5µM) | 1µl | | 2X sgRNA Reaction Mix | 10µl | | RNase Inhibitor (40U/µl) | 1µl | | Enzyme Mix | 2µl | | Total Volume | 20µl |
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注：由于涉及 RNA 操作，需要严格按照 RNA 操作的规范进行，避免 RNase 污染，相关试剂和耗材需要确保是 RNase free 的，或者是经过DEPC 处理已经去除 RNase 的。可以适当通过按比例放大反应体系，以获得更多的 sgRNA 产量。放大反应体系对 sgRNA 的得率基本没有影响。
b.按照上表配制好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用 Vortex 在最低速度轻轻混匀)，瞬时离心。
c.反应条件：37℃孵育 0.5h-4h。通常反应时间越长，生成的 sgRNA 越多。
d.终止反应：70℃孵育 10min 以终止反应。
2.sgRNA 的纯化。
a.取 20μl 转录反应产物，加入 2μl DNase I，37℃孵育 15min 以充分降解 DNA 模板。
b.后续推荐使用如下的酚氯仿抽和乙醇沉淀方法进行 sgRNA 的纯化。也可以使用动物小 RNA 抽提试剂盒(离心柱式)进行 sgRNA 的纯化，但该试剂盒每个纯化柱的抽提容量相对较小一点，不能满足 10-40µg sgRNA 的纯化要求，但可以用于少量 sgRNA 快速纯化和分析鉴定。
c.在上述反应体系中加入 160μl Ultrapure Water，再加入 20μl 3M NaAc, pH5.2 (约 200μl 最终体积的 1/10 体积)，混匀。
d.加入 200μl 水饱和酚/氯仿混合溶液(等体积)，充分 Vortex 混匀以变性蛋白。
e.4℃ 12000-14000g 离心 10min。收集上层液体至新的 1.5ml 离心管(Nuclease free)，加入 2 倍体积无水乙醇，混匀，-20℃沉淀 3h 或-80℃沉淀 1h (如果想得到更高产量的 sgRNA，可以考虑沉淀过夜)。
f.4℃ 12000-14000g 离心 10min。去除上清，加入 1ml 70%乙醇。
g.4℃ 12000-14000g 离心 5min。去除上清，尽量洗净残留液体，打开管盖，室温放置 2-5min 挥发残留乙醇。
h.加入 20μl Ultrapure Water 溶解沉淀，-80℃冻存。sgRNA 的浓度可以通过测定紫外吸收，以及通过电泳染色进行确定。通常一个反应体系可以获得约 5-25μg sgRNA。
3.(选做) 所设计的 sgRNA 的效果鉴定。
a.参考下表在冰浴上配制如下反应体系。 Cas9 Nuclease (SpCas9)可以向阿拉丁购买。
| Reagent | Volume | | Ultrapure water | 20µl | | Cas9 Reaction Buffer (10X) | 3µl | | 1µM Cas9 Nuclease (SpCas9) | 1µl | | 300nM sgRNA | 3µl (30nM final) | | Volume | 27µl | | Pre-incubate for 10min at 25℃ | | 30nM substrate DNA | 3µl (3nM final) | | Total volume | 30µl |
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b.反应条件：37℃孵育 15min。反应时间也可以根据具体的实验目的适当延长至例如 30-120min。
c.终止反应：加入 1µl Proteinase K (Proteinase K, ST533)，混匀，室温孵育 10min。
d.电泳检测：取出 10μl 反应液，加入 2μl DNA 上样缓冲液(6X)进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后使用 NA-Red (EB 升级换代产品)室温染色 15min，并使用凝胶成像系统观察实验结果。
e.结果分析：对于设计的不同的 sgRNA，可以根据电泳结果中对于底物 DNA 的切割效率判定 sgRNA 的设计效果。
常见问题：
1. sgRNA 获得量低。
a. 模板 DNA 质量问题：模板 DNA 中残留的盐、乙醇、酚、氯仿等有机溶剂会影响转录效率。解决方法：重新制备高纯度的 DNA 模板。
b. RNA 酶污染：RNA 酶可以由模板 DNA 或者操作中带入。RNA 酶会降解转录产物，从而使获得的 sgRNA 量减少。
c. 模板 DNA 量不足：每个 sgRNA 转录体系需要试剂盒指定量的 DNA 模板。转录前需要定量 DNA 模板并且电泳检测是否条带单一、清晰。使用更大量的 DNA 模板对于提高 sgRNA 产量有一定帮助。
2. sgRNA 电泳条带模糊、两条带、大小不正确。sgRNA 为 100nt 左右的单链 RNA。在水溶液中容易形成二级结构。因此电泳时位置会发生变化。采用变性后快速冷却处理或者甲酰胺变性凝胶电泳可以显著改善电泳效果。
3. sgRNA 变性琼脂糖凝胶电泳出现显著小于 100nt 的弥散带。RNA 酶污染造成 sgRNA 降解。解决方法：采用高质量的无核酸酶酶污染的耗材进行实验。实验过程中注意防止核酸酶污染。
保存条件：
-20℃保存，≤0℃运输
注意事项：
（1）酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。
（2）严格使用 RNase Free 的实验器材(如吸头、离心管、PCR 管等)，并在操作过程中严格注意避免 RNase 污染。
（3）需要自备的主要试剂：3M NaAc (pH5.2)；无水乙醇；70%乙醇；1:1 水饱和苯酚/氯仿混合溶液。
（4）本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
（5）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
危险品化学品经营许可证（带存储）