生孢梭菌（Clostridium sporogenes）是厌氧菌培养、芽孢形成、菌种保存、食品安全检测和无菌验证研究中常用的代表性梭菌。它具有严格厌氧、革兰阳性杆菌、可形成芽孢和培养体系相对成熟等特点，常被用于建立厌氧培养流程、评价厌氧环境稳定性、制备芽孢悬液和验证菌种保存效果。

        关键词：生孢梭菌；Clostridium sporogenes；厌氧菌培养；梭菌增菌培养基；芽孢形成；菌种保存；冻干保存；厌氧环境控制

图1 生孢梭菌复苏、厌氧培养、芽孢形成与保存验证流程示意图

1 生孢梭菌研究的基本逻辑

1.1 生孢梭菌的研究定位

        生孢梭菌属于梭菌属中较具代表性的产芽孢厌氧菌。与部分高风险产毒梭菌相比，常用生孢梭菌标准株通常不产生肉毒毒素，因此常被作为严格厌氧菌操作、梭菌培养体系、芽孢形成和保存稳定性研究中的模式菌。

（1）厌氧培养模型

        生孢梭菌对氧敏感，培养结果高度依赖培养基还原状态、厌氧系统密闭性、接种转移速度和氧指示剂状态。它适合用于验证实验室厌氧培养流程是否稳定。

（2）芽孢研究模型

        生孢梭菌可在不利条件下形成芽孢，芽孢对热、干燥和保存环境的耐受性明显强于营养细胞。因此，它适合用于芽孢制备、芽孢保存、复苏效率和灭菌挑战相关研究。

（3）应用工具菌

        生孢梭菌可用于食品安全、厌氧发酵、无菌验证和肿瘤缺氧微环境相关研究。但在具体应用中，应明确其是培养与保存模型，不能直接替代产毒梭菌的毒力、毒素表达或致病机制研究。

1.2 培养与保存的核心难点

        生孢梭菌的培养难点集中在两个方面：一是严格厌氧，二是营养细胞与芽孢状态并存。培养成功不能只看液体浑浊，保存成功也不能只看显微镜下存在芽孢。

（1）氧暴露控制

        复苏、划线、挑取单菌落、转接和冻存分装过程中，空气暴露时间过长会影响复苏效率和生长状态。冻干菌、长期冻存菌和低活力菌株尤其依赖稳定的无氧环境。

（2）培养状态判断

        液体培养浑浊只能说明有微生物生长，不能证明为生孢梭菌纯培养。培养后应通过平板分离、菌落形态、革兰染色、芽孢染色或分子鉴定确认。

（3）保存状态判断

        长期保存应关注复苏率、菌落一致性、芽孢比例、传代次数和批次稳定性。仅依靠斜面短期保存或连续传代，容易造成活力下降、污染积累和表型漂移。

2 生物学特性与培养前准备

2.1 基本生物学特性

        生孢梭菌为革兰阳性杆菌，具有运动性，可在不利环境下形成椭圆形芽孢。典型培养条件下，其适宜生长温度多为35–37℃，中性至弱酸性环境更适合生长。

（1）厌氧属性

        生孢梭菌为严格厌氧菌。培养前应保证培养基充分预还原，平板和液体培养体系应尽快置于厌氧环境中。

（2）形态特征

        营养细胞通常为杆状，芽孢形成后菌体可呈膨大或梭形。形态观察只能作为初筛，不能替代菌株鉴定。

（3）生长表现

        液体培养可表现为浑浊、沉淀或产气；平板培养可形成灰白色、边缘不规则或扩展性菌落。不同培养基和菌株状态会影响菌落外观。

2.2 厌氧环境准备

        生孢梭菌培养前应准备稳定的厌氧环境。常用方式包括厌氧工作站、厌氧罐、厌氧袋和厌氧培养箱。若实验涉及大量转接、划线和冻存分装，厌氧工作站更有利于减少氧暴露。

（1）厌氧工作站

        适合复苏、划线、分装、挑菌和连续操作，可在同一无氧环境内完成关键步骤，是严格厌氧菌操作的理想条件。

（2）厌氧罐或厌氧袋

        适合平板静态培养和常规厌氧培养，成本较低，但每次开盖都会造成氧暴露，需要配合厌氧产气体系和氧指示剂使用。

（3）厌氧状态验证

        每次培养应观察厌氧指示剂。若指示剂颜色提示氧暴露，不能继续把该批培养结果作为可靠数据，应重新建立厌氧环境。

2.3 菌种与记录管理

        生孢梭菌培养应使用来源明确、编号清楚、保存状态可靠的菌株。每次复苏、传代、冻存和使用都应记录菌株编号、保存批次、培养基、培养温度、培养时间、厌氧系统和操作者。

（1）菌种来源

        标准菌株或经鉴定菌株更适合用于方法建立和文章实验体系。环境样本或食品样本中分离出的未知梭菌，不能直接按生孢梭菌处理。

（2）传代控制

        连续传代会增加表型漂移和污染风险。建议建立主种子批和工作种子批，日常实验从工作种子批复苏，避免反复启用主种子批。

（3）污染控制

        每批培养建议设置阴性培养基对照和必要的纯度检查。若出现多种菌落形态、需氧条件下明显生长或染色结果混杂，应重新纯化或弃用该批次。

3 培养基选择与应用定位

3.1 复苏与增菌培养基

        生孢梭菌复苏优先选择营养充分、还原状态良好的培养基。梭菌增菌培养基和硫乙醇酸盐培养基适合冻存菌、冻干菌和低活力菌株恢复。培养基使用前应充分预还原，必要时可在使用前进行驱氧处理。

        强化梭菌类培养基适合提高复苏机会，硫乙醇酸盐培养基适合维持较低氧化还原电位。对低活力菌株，不宜直接用普通非选择性平板判断菌种失活，应先液体恢复，再平板分离。

3.2 平板分离培养基

        平板培养用于单菌落分离、菌落形态观察、纯度检查和计数。哥伦比亚琼脂培养基、血琼脂培养基基础配合无菌脱纤维羊血，可用于厌氧菌菌落观察和溶血特征判断。TSA类培养基可用于纯培养物恢复和非选择性培养对照，但不应作为复杂样本中梭菌富集的核心培养基。

3.3 保存与辅助体系

        短期保存可使用半固体培养基、斜面培养基或覆盖隔氧方式，但不建议作为长期保藏方案。长期保存应优先采用-80℃冻存、芽孢悬液保存或冻干保存，并进行复苏验证。

        培养基瓶、琼脂粉、脱脂奶粉、含脱脂牛奶的缓冲体系等虽然不是“培养基”，但与培养基配制、冻干保护和保存体系建立直接相关，适合放入产品表中。

4 生孢梭菌培养操作流程

4.1 冻干菌或冻存菌复苏

        复苏阶段应优先减少氧暴露。冻干菌复水后应尽快接入预还原液体培养基，冻存菌应快速解冻后转入预还原培养体系，避免反复冻融。

（1）冻干菌复苏

        在无菌和尽量低氧条件下，用预还原液体培养基复溶冻干菌粉，轻轻吹打混匀后接入梭菌增菌培养基或硫乙醇酸盐培养基。复苏初期不宜频繁开盖观察。

（2）冻存菌复苏

        冻存管取出后应快速解冻，立即接入预还原培养基。若复苏菌量少或状态弱，可先进行液体富集培养，再转接平板分离。

（3）复苏观察

        培养18–48小时内观察液体培养基浑浊、沉淀、产气和气味变化。若无生长，应优先排查厌氧系统、培养基还原状态和冻存批次，而不是直接判断菌株死亡。

4.2 液体培养

        液体培养适合菌株恢复、增菌、保存前扩增和芽孢制备前培养。接种前培养基应充分预还原，接种后应立即进入厌氧培养条件。

（1）接种控制

        复苏阶段可适当提高接种量；标准化实验应控制接种量、培养基体积和培养时间。不同批次实验应记录起始菌量和培养基批号。

（2）生长判读

        浑浊、沉淀或产气可提示生长，但不能证明纯度。液体培养物用于后续实验前，应划线平板确认菌落一致性。

（3）传代控制

        生孢梭菌不宜长期连续传代。连续传代可能改变营养细胞与芽孢比例，也可能影响后续保存复苏结果。

4.3 固体培养与菌落观察

        固体培养应使用预还原平板。划线后应立即置于厌氧工作站、厌氧罐或厌氧袋中，避免平板在空气中长时间停留。

（1）划线分离

        将液体培养物划线至哥伦比亚琼脂、厌氧菌琼脂或血平板。若需要观察溶血和菌落扩展形态，可选择血琼脂平板。

（2）菌落观察

        观察菌落大小、颜色、边缘、透明度、表面形态、扩展性和溶血情况。菌落形态只作为初步依据，不应替代染色或鉴定。

（3）纯化

        若平板上出现形态明显不同的菌落，应分别挑取纯化，并进行革兰染色或进一步鉴定。混合菌落不应直接用于冻存或芽孢制备。

5 芽孢形成与复苏评价

        生孢梭菌培养物中可同时存在营养细胞和芽孢。营养细胞适合用于生长曲线、代谢活性和短期扩增；芽孢适合用于长期保存、耐受性研究、灭菌验证和复苏稳定性评价。

（1）营养细胞

        营养细胞生长活跃，但对氧、热、干燥和保存环境更敏感。若用营养细胞进行长期保存，应使用合适的冻存保护剂和低温条件。

（2）芽孢

        芽孢耐受性强，但芽孢存在不等于复苏能力稳定。芽孢相关实验应检测芽孢比例、活菌计数和复苏后菌落一致性。

（3）混合培养物

        普通培养物常为营养细胞和芽孢混合状态。若实验目标是芽孢悬液，应通过培养条件和后处理提高芽孢比例，并确认营养细胞残留情况。

5.2 芽孢诱导

        芽孢形成受培养基、培养时间、菌株状态、营养限制和厌氧程度影响。培养时间延长并不必然代表芽孢质量更好，仍需通过显微镜和复苏实验判断。

（1）诱导培养

        可选择适合芽孢形成的培养体系进行延长培养。若使用含淀粉或产孢培养基体系，应记录培养时间、温度和菌株传代次数。

（2）镜检判断

        可通过芽孢染色或显微镜观察评估芽孢比例。若芽孢比例不足，说明培养条件更偏向营养生长，需调整培养基、培养时间或诱导条件。

（3）纯度确认

        芽孢制备前应确认菌株纯度。污染菌进入芽孢悬液后，会直接影响复苏计数、耐受性判断和保存结果。

5.3 芽孢悬液复苏评价

        芽孢悬液保存后应评价复苏率，而不是只记录保存时间。复苏评价包括活菌数、复苏时间、菌落形态、纯度和批间稳定性。

（1）复苏率

        复苏率下降可能与保存温度波动、保护体系不合适、芽孢比例不足或复苏条件不稳定有关。

（2）复苏时间

        芽孢复苏可能存在滞后期。若复苏延迟但菌落形态一致，可能是芽孢萌发速度问题；若长时间无生长，应排查厌氧条件和保存失活。

（3）批次管理

        用于挑战实验或标准化实验的芽孢悬液，应在使用前重新计数，不能直接沿用历史计数结果。

6 生孢梭菌保存方法

6.1 短期保存

        短期保存适用于近期实验使用，可采用平板短期保存、斜面保存、半固体穿刺保存或液体培养物短期转接。短期保存不应超过菌株活力和纯度可控范围。

（1）平板短期保存

        平板便于观察菌落状态，但容易干燥、氧化和污染。超过短期使用窗口后，应从冻存批次重新复苏。

（2）半固体穿刺保存

        半固体培养基可用于短期穿刺保存或运动性观察。若表面覆盖无菌液体石蜡，可降低氧进入，但仍不建议作为长期保存方式。

（3）斜面保存

        普通琼脂斜面可用于短期传代保藏，但对严格厌氧菌而言，氧暴露和干燥风险较高，应配合复苏验证。

6.2 -80℃冷冻保存

        冷冻保存适合建立工作种子批。保存前应选择纯度明确、生长状态稳定的培养物，加入适宜保护剂后分装保存。

（1）保护剂

        甘油是常用冷冻保护剂，也可根据实验体系选择其他保护体系。保护剂应无菌处理，并尽量减少菌体在常温下暴露时间。

（2）分装

        冻存液应小体积分装，每次使用一管，避免反复冻融。每个批次应记录冻存日期、菌株来源、培养条件和复苏结果。

（3）复苏验证

        冻存完成后应抽取代表性冻存管进行复苏验证。若复苏不稳定，该批次不应作为标准工作种子批。

6.3 芽孢悬液保存

        芽孢悬液适合长期保存、耐受性研究和灭菌挑战实验。制备芽孢悬液时应优先保证芽孢比例、菌株纯度和计数稳定性。

（1）收集

        芽孢形成后可收集培养物，并通过洗涤去除培养基残留。若需要降低营养细胞干扰，可采用适当处理区分芽孢与营养细胞。

（2）保存

        芽孢悬液可在合适缓冲体系或保护体系中保存。保存后应定期复苏计数，以确认活性稳定。

（3）使用

        用于实验前应重新混匀和计数。芽孢易聚集，计数前处理不充分会导致重复性差。

6.4 冻干保存

        冻干保存适合长期保藏和运输。冻干前应选择纯度明确、活力稳定的菌株或芽孢悬液，并加入脱脂乳、糖类或复合保护剂。

（1）保护体系

        脱脂奶粉、含脱脂牛奶的缓冲体系、蔗糖、海藻糖和明胶等可作为冻干保护体系参考。具体配方应根据复苏率和保存稳定性优化。

（2）冻干过程

        冻干过程应减少氧暴露，并保证安瓿或容器密封可靠。冻干后必须进行复苏验证。

（3）长期管理

        冻干批次应记录制备日期、保护体系、冻干条件、复苏率和保存位置。长期保存不等于永久稳定，应定期抽检。

7 纯度确认与结果判读

7.1 纯度确认

        生孢梭菌培养后应进行纯度确认。纯度检查应贯穿复苏、传代、芽孢制备、冻存和复苏验证全过程。

（1）平板分离

        通过划线获得单菌落，观察菌落是否一致。混合菌落提示污染或分离不充分。

（2）革兰染色

        典型结果应以革兰阳性杆菌为主。若出现球菌、阴性杆菌或形态混杂，应重新纯化。

（3）芽孢染色

        芽孢染色可确认芽孢形成能力。若长期无法观察到芽孢，应检查培养条件、培养时间和菌株状态。

7.2 生化表型辅助确认

        传统生化鉴别可作为菌株表型确认的辅助工具。明胶液化、石蕊牛奶反应、硝酸盐还原、糖醇发酵和氨基酸代谢试验可帮助了解菌株代谢特征，但不应单独作为最终身份确认依据。

7.3 常见异常与排查

8 生孢梭菌培养、保存与复苏相关产品

        生孢梭菌培养与保存的关键在于控制氧暴露、选择合适培养基、区分营养细胞与芽孢状态，并建立可复苏、可追溯的菌种管理体系。只有把复苏、增菌、平板分离、纯度确认、芽孢评价和保存验证连接起来，才能使生孢梭菌成为厌氧菌研究中稳定可靠的基础模型。

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[1] 微生物的培养和鉴定