在细胞成像、流式和组织切片里，我们最熟悉的可能还是488、555、647这些“可见光”染料。但一旦走到小动物整体成像（in vivo），情况就有点不一样了：要穿透皮肤和组织、要看全身分布，这时候680/750 nm近红外通道就非常有优势。

       Super Fluor 680 / 750 是与 Alexa Fluor 680 / 750 通道相当的国产近红外染料系列，适合做抗体、小分子药物、蛋白的标记，用于小鼠、裸鼠等小动物活体荧光成像。

       本文围绕一个问题：“如果我手上有 Super Fluor 680 / 750，想做小动物活体荧光成像，需要重点关注哪些要点？”

为什么选680 / 750近红外通道？

1. 接近“组织透明窗”，背景低、穿透深

       在650–900 nm的近红外窗口（NIR-I），组织对光的散射和吸收相比可见光明显减弱，自发荧光也大幅降低，因此信噪比和有效穿透深度更好，非常适合用来做小动物整体成像。

(1) Super Fluor 680：激发/发射大致在680/702 nm，光谱类似Alexa Fluor 680、Cy5.5。

(2) Super Fluor 750：激发/发射大致在750/775 nm，光谱类似Alexa Fluor 750、Cy7。

       这两个通道都处在近红外窗口内，组织自发荧光低、背底干净，尤其适合肿瘤、血管、深部组织成像。

2. 与常见成像系统和激光线兼容

大多数小动物成像系统都支持 Cy5.5 / Cy7 或 Alexa Fluor 680 / 750 通道，对应的激发/发射滤光片大致为：

(1) 680 通道：Ex ~ 670–690 nm，Em ~ 700–720 nm

(2) 750 通道：Ex ~ 730–770 nm，Em ~ 780–800 nm（或 790 nm 长通）

Super Fluor 680 / 750 的光谱与这些染料高度重叠，可以直接“对号入座”到现成的Cy5.5 / Cy7通道里，不需要为染料专门定制滤光片。

3. pH 范围宽、亮度高、适合in vivo使用

Super Fluor 系列通常具备：

(1) pH 4–10 范围内荧光基本稳定；

(2) 摩尔消光系数高（ε ~1.8×10⁵–2.4×10⁵ L·mol⁻¹·cm⁻¹），亮度好；

(3) 光稳定性较好，适合多时间点成像；

(4) 以NHS酯形式提供，可以方便地与抗体、蛋白、肽、多糖、小分子药物上的伯胺反应，制成“专一性探针”。

常见探针形式：不仅仅是“把染料打进鼠体里”

在活体成像里，Super Fluor 680 / 750可以有不同“载体”：

1. 自由染料（未偶联）

(1) 水溶性近红外染料直接溶于缓冲液后注射；

(2) 优点：操作简单，可用于验证仪器通道；

(3) 特点：对于亲水性的小分子 Super Fluor 染料，通常极易通过肾脏排泄，短时间内在膀胱聚集，常用来做肾清除或血管造影的快速示踪。

2. 标记 BSA、白蛋白等“血池探针”

(1) 例如文献中常用的BSA–Alexa Fluor 680/750造影剂，用于血管成像和血池成像；

(2) Super Fluor 680 / 750同样可以标记BSA，作为“长循环”的血管造影剂。

3. 标记抗体、受体配体或小分子药物

(1) 最常见的做法：Super Fluor 750标记肿瘤靶向抗体或多肽，用于肿瘤成像、靶向药物分布监测；

(2) 这类探针的体内分布由靶点表达、血药动力学和探针大小共同决定，信号通常在数小时到数天范围内变化。

实战上，一般会用680通道做血管/背景参考，750通道做靶向探针，用于双通道成像和比对。

小动物实验的一般流程：从给药到成像

       下面用“Super Fluor 750标记抗体做肿瘤成像”举一个简化流程示意。具体的动物麻醉、剂量等必须遵守各实验单位的动物伦理规范，这里只给出思路级别的步骤。

1. 动物准备

(a) 推荐使用裸鼠或无毛小鼠：毛少，光散射少，成像效果更好；

(b) 一般体重在18–25 g的雌性或雄性裸鼠；

(c) 实验前保持自由进食饮水即可，如需禁食请按动物中心要求执行。

2. 探针配制与注射

(1)  探针配制

(a) Super Fluor 680 / 750通常以粉末形式提供，-20 ℃干燥避光保存；

(b) 标记好的抗体或蛋白建议：

(i) 溶于生理盐水或PBS，必要时加入少量可耐受比例的有机溶剂（如少量乙醇、PEG、少量DMSO等）；

(ii) 必要时可加入少量DMSO等有机溶剂帮助溶解，终浓度建议尽量< 10%（对于裸鼠或体弱动物建议 < 2%），具体上限严格遵守单位SOP和伦理要求，避免高比例 DMSO 带来的静脉注射毒性风险。

（2）注射途径与体积

(a) 小动物近红外成像中最常见的是尾静脉注射；

(b) 常见单次注射体积约为5–10 mL/kg体重（20 g 小鼠约 100–200 μL），具体上限需遵守动物中心建议。

(c) 具体剂量（mg/kg）需要根据：

(i) 探针的毒性；

(ii) 预期靶向程度；

(iii) 仪器灵敏度:进行小范围探索，一般会先做 2–3 个剂量梯度的预实验。

3. 麻醉与成像时间点

(a) 麻醉方式：可选用吸入异氟烷或单位推荐的注射麻醉方案，不建议照抄他人mg/kg剂量，请遵守动物伦理和SOP。

(b) 常见成像时间点：

(i) 自由染料或血管造影剂：注射后几分钟内信号即遍布全身，随后快速向肾脏/膀胱聚集，可在0、5、15、30、60 min等时间点成像；

(ii) 抗体或靶向探针：一般需要数小时甚至24–48小时才能在靶点富集，可在1、4、8、24 h甚至更久的时间点进行观察。

成像时将小鼠俯卧或仰卧平放在成像箱中，保持体温和呼吸稳定，避免体位改变带来的信号差异。

成像系统与参数设置：如何“把通道用对”

不同品牌的小动物成像系统菜单界面不一样，但几个核心参数是一致的。

1. 通道设置（以 Super Fluor 750 / Cy7 通道为例）

参考常见Cy7 / Alexa Fluor 750成像参数：

(a) 激发滤光片（Excitation）：700–770 nm带通（或中心 ~740–750 nm）

(b) 发射滤光片（Emission）：约790 nm长通或780–820 nm带通

(c) 若同时使用680通道：

(i) Ex ~ 660–690 nm

(ii) Em ~ 700–720 nm

选择参数时，只要找到与Alexa Fluor 680 / 750 或 Cy5.5 / Cy7对应的预设通道，将Super Fluor 680 / 750 探针映射上去即可。

2. 曝光时间与灵敏度

(a) 曝光时间：从几百毫秒到几秒不等，先用短时间预览，避免强信号区域饱和，再适当延长曝光；

(b) 增益/灵敏度：在不引入明显噪声的前提下尽量提高；

(c) 如做多时间点或多动物对比，尽量保持相同的成像参数，便于后续定量分析。

信号变化与结果解读：你会看到什么？

结合Super Fluor 680 / 750与类似Alexa Fluor染料的公开资料，一般会观察到：

1. 自由染料 / 小分子探针

(a) 注射后几分钟内，全身血池和主要脏器出现近红外信号；

(b) 随时间推移，信号逐渐从全身淡出，向肾区和膀胱集中，呈明显肾排泄特征；

(c) 可用于评价肾功能、血流灌注等。

2. BSA 或大分子“血池造影剂”

(a) 长时间停留在血管和高血流组织（心、肺、肿瘤血管等）；

(b) 适合做血管示踪、肿瘤血管渗漏（EPR 效应）等。

3. Super Fluor 750 标记抗体/靶向分子

(a) 早期以血池信号为主；

(b) 几小时至1–2天内，在表达靶分子的肿瘤或组织中出现持续增强的信号；

(c) 非靶组织中信号逐渐降低，靶/非靶比提高。

常见问答（FAQ）

1）什么类型的小鼠更适合活体荧光成像？

优先选择裸鼠或无毛小鼠，毛发对光有明显散射和遮挡，尤其对近红外波段的皮肤反射有影响。

2) 注射体积和溶剂该怎么选？

(a) 对20 g左右小鼠，尾静脉单次注射体积建议控制在百微升级别（例如 100–200 μL 范围），具体上限遵照动物中心规范；

(b) 尽量使用生理盐水或PBS作为主溶剂，有机溶剂（如DMSO）的体积分数尽可能低；

(c) 若探针难溶，可先在少量DMSO中溶解，再用缓冲液稀释至可接受比例。

3) 标记抗体的 DOL（F/P 值）需要控制在多少？

(a) 对于NIR染料标记抗体，很多经验推荐的DOL大致在2–5之间；若用于体内成像，往往更偏向1.5–3这样相对保守的范围，以兼顾亮度和体内行为。；

(b) 过低会导致信号太弱，过高可能引起：

(i) 抗体亲和力下降；

(ii) 非特异结合增多；

(iii) 染料自猝灭、荧光反而变暗。

因此建议在一个较宽的范围内做 2–3 个 DOL 条件进行比较，选出信噪比最好的一档。

4) 游离染料去不干净会有什么影响？

(a) 会在成像早期出现全身高背景和强烈膀胱信号；

(b) 容易误判“全身都发光”，但实际上大部分只是未结合染料；

(c) 建议使用G-25 / P-30脱盐柱或透析仔细去除游离染料，必要时重复一次。

5）可以把 Super Fluor 680 / 750与生物发光成像一起用吗？

可以。许多系统支持荧光 + 生物发光双模态成像，例如将Super Fluor 750 标记探针与 D-luciferin / luciferase系统结合，用不同通道分别观察结构和功能信号。

安全和合规提醒

(a) Super Fluor 680 / 750 及其标记探针仅限科研使用，不得用于人体或临床诊断治疗；

(b) 所有动物实验必须通过本单位动物伦理委员会审批，麻醉、给药、安乐死方案需执行本单位的官方SOP；

(c) 操作染料和有机溶剂时注意佩戴手套、护目镜，避免皮肤和眼睛接触；

(d) 废液和动物尸体需要按生物危废规范处理。

阿拉丁近红外荧光染料及生物发光系统D-Luciferin / Luciferase

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