1 概述

1.1 目的与适用范围

        本规程用于建立小鼠骨组织常规脱钙实验流程，适用于骨组织石蜡切片前处理及后续组织学分析。根据后续检测目的不同，可选用快速脱钙法或慢速脱钙法。快速脱钙法适用于以HE染色为主的常规形态学观察；慢速脱钙法适用于对抗原保存要求较高的免疫组化、免疫荧光及其他组织化学分析。

1.2 方法原理

（1）骨组织中含有大量钙盐，未经脱钙难以获得连续、完整的切片。

（2）快速脱钙法采用酸性脱钙液，使骨组织中的钙盐较快溶解，处理时间短，但对抗原和部分精细结构保存不利。

（3）慢速脱钙法采用EDTA螯合脱钙，速度较慢，但对组织抗原性和组织结构保存较好。

2 材料与试剂

2.1 样本类型

（1）小鼠长骨、椎骨、颅骨及其他需脱钙处理的骨组织。

2.2 主要试剂

（1）固定液。

（2）硝酸脱钙液。

        配方：硝酸10 ml、冰醋酸20 ml、甲酸50 ml、水70 ml、甲醛10 ml。

（3）10%EDTA脱钙液。

        配方：取10 g EDTA溶于10%中性甲醛，配成100 ml。

（4）5%硫酸钠水溶液。

（5）蒸馏水或流水。

（6）梯度乙醇、透明剂及包埋相关试剂。

2.3 器材

（1）镊子、剪刀、解剖器械。

（2）样本瓶或脱钙容器。

（3）4℃冰箱。

（4）通风橱。

（5）大头针或细针。

3 样本准备

3.1 取材

（1）取过度麻醉致死小鼠所需部位骨组织。

（2）尽量去除附着的肌肉、脂肪及多余软组织，以利固定和脱钙液渗入。

3.2 固定

（1）将骨组织放入固定液中固定约24 h。

（2）固定液体积应明显高于标本体积，保证充分固定。

3.3 脱钙前处理

（1）固定结束后取出骨组织。

（2）必要时可根据样本大小适当修整，以缩短脱钙时间并提高一致性。

4 快速脱钙法

4.1 脱钙

（1）将固定后的骨组织置于硝酸脱钙液中。

（2）脱钙液液面应高于标本约3 cm，或保证标本被充分浸没。

（3）室温条件下进行快速脱钙。

4.2 终点判断

（1）采用大头针或细针轻刺骨组织。

（2）以可轻松刺入为脱钙终点。

（3）成年小鼠骨组织通常约需7 h，实际时间应根据骨组织大小、厚度及致密程度调整。

4.3 中和处理

（1）脱钙完成后，取出标本。

（2）立即置于5%硫酸钠水溶液中进行中和处理。

（3）中和时间可控制在30 min～2 h；若样本较大或对后续染色一致性要求较高，可适当延长。

4.4 冲洗

（1）中和后将标本置于流水下充分冲洗。

（2）冲洗时间以5～10 min为宜，必要时可适当延长。

4.5 后续处理

（1）冲洗完成后，按常规流程进行脱水、透明、包埋和切片。

5 慢速脱钙法

5.1 脱钙

（1）将固定后的骨组织置于10%EDTA脱钙液中。

（2）于4℃条件下进行慢速脱钙。

（3）每4～5 d更换1次脱钙液。

5.2 终点判断

（1）每天观察骨组织状态。

（2）采用大头针或细针试探，以可轻松刺入为脱钙终点。

（3）慢速脱钙所需时间明显长于快速脱钙，应根据骨组织类型和体积灵活掌握。

5.3 冲洗

（1）脱钙完成后取出骨组织。

（2）以蒸馏水冲洗后进入后续处理步骤。

5.4 后续处理

（1）冲洗后可直接进行常规脱水、透明、包埋和切片。

6 结果与适用建议

6.1 快速脱钙法

（1）优点为速度快、形态保持相对较好，适合常规HE染色。

（2）局限在于酸性条件对抗原保存不利，不适合对抗原性要求高的后续分析。

6.2 慢速脱钙法

（1）优点为抗原保存较好，更适合免疫组化、免疫荧光等后续检测。

（2）局限在于脱钙时间长，对温度和换液管理要求更高。

7 关键控制点

7.1 固定时间

（1）固定不足会影响组织结构和后续脱钙均一性。

（2）固定过短时，骨髓和软组织区域更易出现结构欠佳。

7.2 脱钙终点判断

（1）脱钙不足会导致切片困难、刀痕明显或组织撕裂。

（2）脱钙过度会引起组织松散、染色减弱及抗原损失。

7.3 快速脱钙后的酸残留处理

（1）快速脱钙后的中和和冲洗步骤应充分。

（2）若酸残留较多，后续脱水、包埋和染色质量可能受影响。

7.4 慢速脱钙换液

（1）EDTA脱钙液应按周期更换。

（2）长期不换液会降低脱钙效率并延长总实验时间。

8 常见问题与原因分析

8.1 切片困难

（1）脱钙不足。

（2）骨皮质区域仍存在残余钙盐。

8.2 组织发软、结构模糊

（1）脱钙过度。

（2）快速酸脱钙时间过长。

8.3 HE染色效果差

（1）快速脱钙后酸残留未充分去除。

（2）中和和水洗不足。

8.4 免疫染色信号弱

（1）采用了快速酸脱钙法。

（2）酸性脱钙导致抗原破坏较重。

9 安全与操作规范

9.1 个人防护

（1）实验过程中应穿实验服并佩戴一次性手套。

（2）处理硝酸、甲酸、冰醋酸及甲醛时应在通风橱中操作。

9.2 废液处理

（1）酸性脱钙废液、中和废液及固定液废液应分类收集。

（2）所有废液应按实验室化学危险废物处理规范处置。

10 相关试剂与材料选型

表1骨组织脱钙（快速法与慢速法）相关试剂与材料选型