沉淀法是蛋白纯化初期的经典技术，优势为设备简单、操作便捷、能浓缩样品并保收率，但纯度提升有限，仅用于初步纯化。以下是四种常用方法的核心要点：

一、盐析法（实验室首选）

1.原理：向蛋白溶液中加中性盐（如硫酸铵），低盐时蛋白溶解度略升（盐溶），高盐时盐离子夺取蛋白表面水合层，暴露疏水基团，使蛋白凝聚沉淀；不同蛋白析出的盐浓度不同，可通过“分级沉淀”先除杂蛋白、再获目的蛋白。

2.操作要点：

• 优先选硫酸铵（成本低、溶解度高，4℃下饱和浓度近4mol/L，受温度影响小）；
• 全程4℃操作（防蛋白变性），缓慢加硫酸铵并低速搅拌，避免局部盐浓度过高；
• 用氨水调pH至6.0~7.5（抵消硫酸铵的酸化作用），若蛋白对重金属敏感，可加EDTA；
• 需预实验确定“最优饱和度”：取等量蛋白液，分别加硫酸铵至20%~90%饱和度，离心后检测目的蛋白含量，筛选去杂与沉淀目的蛋白的最佳浓度。

3.优缺与适用：温和不易变性，适合绝大多数水溶性蛋白；但需高速离心（10000g），后续若需层析需脱盐。

二、有机溶剂沉淀法

1.原理：有机溶剂（丙酮、乙醇为主）破坏蛋白分子间氢键，使蛋白空间结构局部改变，暴露疏水基团；同时降低溶液介电常数，增强疏水相互作用，促使蛋白沉淀。

2.操作要点：

• 全程0℃以下（盐水冰浴），溶剂需预冷至-20℃（防蛋白变性）；
• 缓慢滴加预冷溶剂（等体积丙酮或4倍体积乙醇），低速搅拌，避免局部浓度过高；
• 离心机转子预冷，10000g离心5~15min（0~4℃），沉淀用缓冲液溶解，弃去不溶的变性蛋白；
• 蛋白浓度需≥1mg/ml，避免溶剂稀释后沉淀效率下降。

3.优缺与适用：沉淀剂易挥发无残留，离心分离便捷；但易致蛋白变性，不适用于膜蛋白（会被溶剂溶解），适合对残留敏感的样品。

三、等电点沉淀法

1.原理：蛋白是两性电解质，当溶液pH调至其等电点（pI）时，蛋白净电荷为零，静电排斥消失，仅存静电引力，溶解度最低而沉淀。

2.操作要点：

• 用稀盐酸/氢氧化钠缓慢调pH，搅拌平缓，避免局部pH骤变导致蛋白变性；
• 多数蛋白pI偏酸性（如血清蛋白pI=4.9、脲酶pI=5.0），此时用低成本无机酸调节即可；
• 沉淀后用pH远离其pI的缓冲液溶解，恢复蛋白溶解度。

3.优缺与适用：成本极低、操作简单；但不适用于对低pH敏感的蛋白，常与其他方法联用（如盐析）提升去杂效果。

四、聚乙二醇（PEG）沉淀法

1.原理：PEG（非离子聚合物）在溶液中形成网状结构，通过“空间排斥作用”占据蛋白周围溶剂空间，迫使蛋白分子凝聚沉淀。

2.操作要点：

• 选分子量6000或20000的PEG（分子量高则所需浓度低，但黏度会升高；＜4000的PEG沉淀效率差）；
• 向100ml蛋白液中加100~150ml 50% PEG溶液，30℃以下搅拌60min，5000g离心30min；
• 蛋白浓度需＜10mg/ml，避免浓度过高导致杂蛋白共沉淀。

3.优缺与适用：无毒、不可燃，条件温和且能保护蛋白活性；适合对盐或有机溶剂敏感的蛋白（如酶类），但高黏度PEG会增加操作难度。

五、总结

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