1 概述

1.1 目的与适用范围

        本规程用于建立Feulgen染色的常规操作流程，适用于培养细胞盖片、组织切片、细胞学涂片及染色体制片中DNA的特异性显示，可用于细胞核DNA定位观察、染色体结构研究以及DNA相对含量分析。

1.2 原理简介

（1）Feulgen反应是经典的DNA特异性显示方法。标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，使脱氧核糖C-1位暴露游离醛基。

（2）Schiff试剂中的无色品红可与上述醛基反应，重新形成紫红色化合物，因此细胞中存在DNA的部位呈紫红色阳性反应。

（3）该反应对DNA具有较好的专一性，可较清晰地显示细胞核及染色体结构，并可利用显色强度与DNA含量近似成正比的特点进行相对定量分析。

1.3 实验质量要求

（1）细胞核或染色体呈清晰、稳定的紫红色。

（2）胞质背景较低，核结构边界清楚。

（3）同批标本染色强度一致，便于组间比较和相对定量分析。

2 材料与试剂

2.1 样本类型

（1）培养细胞盖片标本。

（2）石蜡组织切片。

（3）细胞学涂片。

（4）染色体铺片或压片标本。

2.2 主要材料

（1）HeLa人宫颈癌上皮细胞或其他待测细胞。

（2）载玻片与盖玻片。

（3）尖头镊子、吸管、吸水滤纸。

2.3 主要试剂

（1）Hanks液。

（2）1 mol/L盐酸。

（3）Schiff试剂。

（4）Carnoy固定液（甲醇:冰醋酸=3:1）。

（5）0.5%亮绿。

（6）蒸馏水。

（7）70%乙醇。

（8）80%乙醇。

（9）95%乙醇。

（10）无水乙醇。

（11）二甲苯。

（12）中性树胶。

2.4 仪器与器材

（1）普通光学显微镜。

（2）恒温水浴箱。

（3）CO2培养箱。

（4）染色缸。

3 染液与样本准备

3.1 Hanks液准备

（1）原液甲

        NaCl 160 g，KCl 8 g，MgSO4·7H2O 2 g，MgCl2·6H2O 2 g，溶于800 mL蒸馏水中；另将无水CaCl2 2.8 g溶于100 mL蒸馏水中。混合两液后加水至1000 mL，滤过后加入2 mL氯仿防腐，4℃保存。

（2）原液乙

        Na2HPO4·12H2O 3.04 g，KH2PO4 1.2 g，葡萄糖20.0 g，溶于800 mL蒸馏水中，滤过后加入0.5%酚红80 mL，再加水至1000 mL，最后加入2 mL氯仿防腐，4℃保存。

（3）使用液

        取原液甲与原液乙各1份，加入双蒸水18份，混匀分装，经高压灭菌后4℃保存。临用前用无菌5.6% NaHCO3调至所需pH值。

3.2 Schiff试剂准备

（1）取碱性品红0.5 g加入100 mL煮沸的蒸馏水中，继续煮沸5 min并搅拌使其充分溶解。

（2）冷却至50℃后过滤至棕色瓶中，加入1 mol/L盐酸10 mL。

（3）冷却至25℃后加入1 g无水亚硫酸氢钠，充分振荡后避光放置过夜。

（4）次日加入0.25 g活性炭，剧烈振荡1 min后过滤。所得溶液应为完全无色。

（5）Schiff试剂应避光、低温、密封保存，使用前恢复至室温。

3.3 固定要求

（1）Feulgen染色以Carnoy固定液效果较好，适合细胞和组织DNA显示。

（2）用于相对定量分析时，应统一固定液类型和固定时间，减少前处理差异。

（3）固定后样本应避免反复干燥和污染。

3.4 对照设置

（1）每批染色宜设置未水解对照。

（2）对照切片或盖片不经盐酸水解，直接进入Schiff试剂，理论上应为阴性或极弱反应。

（3）未水解对照在Schiff试剂中的时间不宜过长，通常控制在0.5 h左右，避免因试剂本身酸性造成假阳性。

4 实验流程

4.1 细胞培养与盖片制备

（1）将HeLa细胞接种于盖片上培养。

（2）培养24～48 h，使细胞生长为单层。

（3）操作过程中应标记盖片细胞面，避免后续冲洗时损伤细胞层。

4.2 清洗与固定

（1）取细胞盖片1张，用Hanks液（pH 7.2～7.4）漂洗3次。

（2）用吸水滤纸轻吸去多余液体，不得直接摩擦细胞面。

（3）将盖片置于Carnoy固定液中固定30 min。

（4）固定后用蒸馏水洗3次。

4.3 稀盐酸水解

（1）将盖片置于1 mol/L盐酸中。

（2）于60℃恒温水浴中水解10 min。

（3）水解结束后立即取出，用蒸馏水洗1次，以终止进一步反应。

4.4 Schiff反应

（1）将盖片移入Schiff试剂中。

（2）于暗处反应30 min。

（3）操作中应尽量减少Schiff试剂暴露于空气，并注意避光。

4.5 冲洗与显色

（1）Schiff反应后用流水冲洗5 min。

（2）再以蒸馏水洗3次。

（3）此阶段DNA阳性部位应逐步呈现稳定的紫红色。

4.6 复染

（1）将盖片置于0.5%亮绿中复染1～3 min。

（2）复染不宜过深，以免掩盖核DNA信号。

（3）若研究重点为纯粹DNA定位，也可根据体系优化复染强度。

4.7 脱水、透明与封片

（1）依次经70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇和无水乙醇梯度脱水。

（2）将盖片浸入二甲苯中透明5 min。

（3）于载玻片上滴加1滴中性树胶。

（4）将盖片细胞面朝下封片。

（5）封片后避免产生气泡，并保持胶液分布均匀。

5 参考操作顺序

HeLa细胞盖片培养24～48 h→Hanks液漂洗3次→Carnoy固定30 min→蒸馏水洗3次→1 mol/L盐酸，60℃水解10 min→蒸馏水洗1次→Schiff试剂暗处反应30 min→流水冲洗5 min→蒸馏水洗3次→0.5%亮绿复染1～3 min→70%乙醇→80%乙醇→95%乙醇→无水乙醇梯度脱水→二甲苯透明5 min→中性树胶封片→镜下观察

6 结果判读要点

6.1 细胞核与染色体

（1）细胞核及染色体中DNA丰富区域应呈紫红色或红紫色。

（2）核染色均匀时，核边界及染色质分布较清晰。

（3）染色体标本中应能较好显示染色体轮廓和浓染区域。

6.2 胞质背景

（1）胞质一般不呈典型Feulgen阳性反应。

（2）亮绿复染适宜时，胞质呈淡绿色背景，有利于突出核DNA信号。

6.3 对照样本

（1）未水解对照应为阴性或近阴性。

（2）若未水解对照出现明显紫红色反应，应优先考虑假阳性或操作条件不当。

7 质控要点

7.1 固定质量控制

（1）Carnoy固定液通常更适合Feulgen反应。

（2）不同固定剂会影响反应强度和稳定性，同类实验中应尽量统一固定体系。

（3）用于定量分析时，固定液和固定时间必须保持一致。

7.2 水解条件控制

（1）水解时间和温度是本实验最关键的技术变量。

（2）水解不足会导致游离醛基暴露不充分，反应减弱。

（3）水解过度会使DNA进一步降解，染色同样减弱，严重时可出现阴性反应。

（4）常规条件下水解时间一般控制在10～15 min，并根据标本类型适当调整。

7.3 Schiff试剂控制

（1）Schiff试剂质量直接决定显色效果。

（2）试剂暴露于空气中易被氧化而变红，试剂一旦失效应停止使用。

（3）同批实验宜尽量使用同一批次Schiff试剂。

7.4 盖片操作控制

（1）本实验采用盖片培养细胞，应在整个过程中明确盖片正反面。

（2）流水冲洗时应避免水流直接冲击细胞面，以防细胞层脱落或破坏。

8 常见问题与原因分析

8.1 染色过浅

（1）水解不足。

（2）Schiff试剂活性下降或失效。

（3）固定不当，尤其使用不适合的固定体系时反应较弱。

（4）流水显色时间不足。

8.2 染色减弱或假阴性

（1）水解过度。

（2）盐酸温度过高或处理过久。

（3）脱氧核糖进一步丢失，导致与Schiff反应能力下降。

8.3 背景偏高或假阳性

（1）未水解对照在Schiff试剂中停留过久。

（2）Schiff试剂被空气氧化污染。

（3）冲洗不充分，未结合染料残留。

8.4 细胞层破坏或染色不均

（1）盖片正反面辨认不清，操作中损伤细胞面。

（2）流水直接冲击细胞层。

（3）固定、洗片或脱水过程中操作过于粗暴。

9 应用范围

9.1 DNA定位观察

（1）用于显示细胞核中DNA存在部位及分布。

（2）适用于染色体和核结构研究。

9.2 细胞学与组织学分析

（1）用于细胞核形态及染色质结构观察。

（2）有利于鉴别不同核结构和分化程度的细胞。

9.3 DNA相对定量分析

（1）可利用显色强度与DNA含量近似成正比的特点进行相对测定。

（2）适合与图像分析或显微定量方法结合应用。

10 安全与操作规范

10.1 个人防护

（1）实验过程中应穿实验服并佩戴一次性手套。

（2）处理盐酸、Carnoy固定液、二甲苯及Schiff试剂时应在通风条件良好的环境下操作。

10.2 废液处理

（1）含盐酸、Schiff试剂、乙醇及二甲苯的废液应分类收集。

（2）所有废液与污染耗材应按实验室化学品处理规范处置。

11 Feulgen染色关键试剂与材料选型

更多相关文章，详见下方：

[1] DNA 的 Feulgen 染色法