一、目的与适用范围

       通过含Ni²⁺等过渡金属离子的螯合填料或磁珠，对带组氨酸标签（His-tag）的重组蛋白进行特异性亲和纯化。本方法适用于细菌或真核表达体系中携带N端、C端或双端His标签的可溶性蛋白及变性条件下的包涵体蛋白。

二、纯化原理

       组氨酸侧链咪唑基团可与Ni²⁺、Co²⁺等过渡金属离子形成配位键。将这些金属离子通过多齿配基（如IDA、NTA、TED等）固定在层析填料或磁珠表面后，His标签蛋白可选择性地与其结合，而其他蛋白则难以形成稳定配位，从而实现与复杂背景蛋白的分离。Ni²⁺与His标签的配位主要通过咪唑环中的N原子实现。可与金属离子配位的氨基酸除组氨酸外，还包括半胱氨酸和色氨酸；过渡金属离子与His标签结合强度大致顺序为：Cu²⁺>Ni²⁺>Zn²⁺>Co²⁺。

三、His标签类型

1.串联组氨酸：4–10个His串联，常用6×His。

2.重复HN模块：His-Asn-His-Asn-His-Asn-His-Asn-His-Asn-His-Asn（6×HN）。

3.HAT标签：

Lys-Asp-His-Leu-Ile-His-Asn-Val-His-Lys-Glu-Glu-His-Ala-His-Ala-His-Asn-Lys。

四、Ni螯合填料/磁珠及配基选择

1.常用配基结构与特性

典型配基包括IDA、NTA、TED，其与Ni²⁺的配位价数、与His标签结合强弱及载量存在差异，一般可概括如下：

（1）IDA：与Ni²⁺形成三齿配位，留给His标签的位点较多，结合能力相对较强，载量高，但非特异性结合及杂蛋白共结合可能相对增加。

（2）NTA：与Ni²⁺形成四齿配位，结合His标签能力中等，载量中等，兼顾结合强度与选择性。

（3）TED：与Ni²⁺形成五齿配位，留给His标签的位点最少，结合相对较弱，载量低，但在选择性及抗污染性能方面具有优势。

2.耐受条件与还原剂使用

上述配基的Ni填料或磁珠一般可耐受8 M尿素和6 M盐酸胍，可用于变性条件下的His标签蛋白纯化。

（1）Ni-IDA 亲和层析介质：样品和缓冲液中应避免使用还原剂，否则可能将Ni²⁺还原、导致填料变棕色并丧失结合能力。

（2）Ni-NTA 亲和层析介质：可使用低浓度还原剂，如5 mM DTE、5 mM DTT、20 mM β-mercaptoethanol、5 mM TCEP或10 mM还原型谷胱甘肽。

（3）Ni-TED亲和层析介质：可耐受较高浓度还原剂，并可耐受1 M NaOH和100 mM EDTA，适用于真核细胞表达His标签蛋白的纯化及较高强度的清洗再生条件。

五、柱填料法His标签蛋白纯化流程

       以下流程适用于预装或自装Ni螯合填料层析柱。各步骤pH推荐控制在7.0–8.0之间。

1.柱平衡

       使用与破碎上清尽量一致的缓冲体系平衡填料，常用缓冲液为含300 mM NaCl的50 mM Tris或20 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.5–8.0），可加入终浓度10–20 mM咪唑抑制非特异性结合。上柱前至少以5–10个柱体积（CV）缓冲液进行平衡，直至基线稳定。

2.上样

       根据样品蛋白含量和填料体积合理控制上样量和流速，一般要求样品在填料中的停留时间不少于1 min，以保证His标签蛋白有充分时间与Ni填料结合。可采用重力流或低压泵上样，避免过高压力和泡沫产生。

3.洗杂

       采用平衡缓冲液或在此基础上适当提高咪唑浓度的洗杂缓冲液（如20–40 mM咪唑）进行洗涤，洗杂体积通常不小于5CV。增加洗杂体积及适度提高洗杂缓冲液中咪唑浓度，有助于去除非特异性结合蛋白，提高洗脱峰纯度。

4.洗脱

       可根据实验目的选择不同洗脱策略：线性梯度洗脱是从较低至较高咪唑浓度（如20–500 mM）线性梯度洗脱，适合首次摸索洗脱条件。分步梯度洗脱需设置多个固定咪唑浓度台阶（如50、100、200、300 mM），逐步洗脱结合能力不同的蛋白，便于条件优化及分段收集。一步洗脱是对于杂蛋白含量较低的样品，可直接采用单一较高咪唑浓度（如250–300 mM）洗脱目标蛋白。收集洗脱峰分级检测（如SDS-PAGE），选取含目标蛋白的组分合并后进行后续缓冲液置换或抛光层析。

六、磁珠法His标签蛋白纯化流程

       以下流程适用于Ni螯合磁珠，在旋转或摇床条件下进行批量吸附。各步骤pH同样推荐控制在7.0–8.0。

1.平衡

       用与破碎上清相同或兼容的缓冲液平衡磁珠，常用条件同柱法：含300 mM NaCl的50 mM Tris或20 mM磷酸盐缓冲液（可含10–20 mM咪唑）。将磁珠悬浮于平衡缓冲液中，轻轻混匀，置于磁力架上分离后弃上清，反复2–3次。

2.孵育结合

       将待纯化的样品加入平衡好的磁珠悬液中，置于旋转培养器或摇床上轻柔混匀孵育，一般0.5–2 h，保证His标签蛋白充分与磁珠表面的Ni²⁺结合。孵育结束后，将悬液置于磁力架上收集磁珠，弃去上清。

3.洗涤

       加入洗杂缓冲液（配方与柱法洗杂缓冲液相同或相近），轻柔混匀后在磁力架上分离上清。洗涤过程一般重复3–5次，以去除非特异性结合蛋白。可根据纯度要求调整咪唑浓度和洗涤次数。

4.洗脱

       向洗涤后的磁珠中加入含高浓度咪唑的洗脱缓冲液，置于旋转培养器或摇床上孵育2–3 min，使目标蛋白从磁珠上解离。随后将混合液置于磁力架上分离磁珠，收集上清即为洗脱的His标签蛋白。如需提高回收率和浓度，可重复洗脱1–2次并合并洗脱组分。

阿拉丁：https://www.aladdin-e.com