人全血血小板分离术
人全血血小板分离术
血小板分离术是一种通过物理或化学方法从全血中分离和富集血小板的技术。它在医学和生物学研究中具有重要应用。如分离获得的血小板，可用于血小板功能研究、信号通路分析、疾病标志物检测等。临床上，还可制备富血小板血浆（PRP），用于组织修复和再生医学。
为了防止血小板在操作过程中被激活，应避免使用强力的机械力（例如快速移液、剧烈摇晃）。此外，研究人员可以选择添加适合其研究和实验目标的抑制剂。实验过程中所有缓冲液，除非另有说明，否则均应在4°C下储存和使用。
采血注意事项：（1）务必确保潜在献血者在抽血前两周未服用会干扰血小板研究和血小板功能的药物（例如抗组胺药、阿司匹林、非甾体抗炎药）。（2）建议使用聚丙烯、聚乙烯或聚碳酸酯实验室器皿来处理和储存血小板。（3）血液是体液，应被视为具有生物危害性。应始终穿戴防护装备，并应根据研究人员所在机构的规定处理血液。
第一阶段 血液分馏
首先需要获取全血并通过离心制备富含血小板的血浆（PRP）。离心条件可能有很大差异（例如从 800 × g 5分钟到100 × g 20分钟），可根据实验具体情况选择。
采血员应将血液抽入 Becton Dicinson Vacutainer®（内含ACD，黄色盖子）或含有1/10 体积CPD缓冲液的塑料注射器中。所需血液量取决于具体的实验。一般来说，40 - 45 mL血液平均可产生1 - 3 × 109个血小板。
所需缓冲液试剂及配方如下：
（1）ACD 缓冲液（酸性-柠檬酸盐-葡萄糖）：39 mM柠檬酸、75 mM柠檬酸钠、135 mM葡萄糖、pH 7.4。
使用前，请先加热至室温，并根据需要调节pH值。
（2）CPD 缓冲液（柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖）：16 mM柠檬酸、90 mM柠檬酸钠、16 mM NaH2PO4、142 mM葡萄糖、pH 7.4。
使用前，请先加热至室温，并根据需要调节pH值。
实验步骤
1.采血员按照严格的采血流程进行采血。采集后立即置于18-25°C，禁止震荡，2小时内处理完毕。
2.室温下以200 × g离心20分钟。
3.离心后，血液分层：
下层：红细胞（占总体积的50 - 80%）
中间层（灰白层）：非常薄的白细胞带（也称为“白膜”）
上层（黄色）：PRP（富含血小板的血浆）
4.用宽口移液管轻缓吸取上层PRP至新管（避免吸入中层白细胞）。
第二阶段 血小板分离
实验步骤
1.按1:1比例（v/v）往PRP中添加HEP缓冲液。加入前列腺素 E1（PGE1, 1 µM 最终浓度）以防止血小板活化。
HEP缓冲液（HEP是指缓冲液中的HEPES）配方：140 mM NaCl、2.7 mM KCl、3.8 mM HEPES、5 mM EGTA、pH 7.4。
使用前，请先加热至室温，并根据需要调节pH值。
2.缓慢倒置试管，轻柔混匀。
3.室温下以100 × g的速度旋转15 - 20分钟（不减速），以沉淀污染的红细胞和白细胞。
4.使用宽口移液管将上清液转移到新的塑料管中。
5.室温下以800 × g的速度离心15 - 20分钟（不停机），沉淀血小板，弃去上清液。
6.轻轻地加入洗涤缓冲液，然后用移液器慢慢除去，以冲洗血小板（无需重新悬浮，以避免不必要的血小板活化）。
血小板洗涤缓冲液配方：10 mM柠檬酸钠、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1%（w/v）葡萄糖、pH 7.4。
使用前，请先加热至室温，并根据需要调节pH值。
7.按照上一步重复洗涤一次。
8.用宽口移液管吸取含有5 mM葡萄糖和新鲜添加3 mg/ml BSA的Tyrode's缓冲液，沿管壁缓慢释放缓冲液，将沉淀物重悬，动作轻缓并尽量减少搅动。
Tyrode's缓冲液配方：134 mM NaCl、12 mM NaHCO3、2.9 mM KCl、0.34 mM Na2HPO4、1 mM MgCl2、10 mM HEPES、pH 7.4。
根据实验情况，将缓冲液加热至室温或在使用前放在冰上。
为了防止血小板活化，可添加PGE1（1 µM）和/或腺苷三磷酸双磷酸酶（0.2 U/ml 最终浓度）。
注意：如果在后续实验中需要激活血小板，则此步骤省略添加PGE1和腺苷三磷酸双磷酸酶。
如果要制备静态血小板裂解物，需按照1:1比例添加冷却的Tyrode's缓冲液和2×血小板裂解缓冲液混合物，其中包括蛋白酶抑制剂。
2×血小板裂解缓冲液配方：2% NP40、30 mM HEPES、150 mM NaCl、2 mM EDTA、pH 7.4。
9.使用血细胞计数器或其他仪器计数血小板，如有需要，可使用Tyrode's缓冲液调整血小板浓度。
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