1 概述

1.1 目的与适用范围

        本规程用于建立 Mallory 磷钨酸苏木素法的常规染色流程，适用于石蜡组织切片中横纹肌横纹、纤维蛋白及神经胶质纤维的显示，也可辅助观察胶原纤维、软骨基质及粗大弹性纤维等组织成分，适合横纹肌相关组织、炎症渗出组织及神经病理相关组织的形态学研究。

1.2 原理简介

（1）Mallory 磷钨酸苏木素法属于经典的 PTAH 染色方法。该方法以磷钨酸和苏木素形成的复合染色体系为基础，对不同组织结构表现出较强的选择性着色能力。

（2）自然氧化法制备的 Mallory PTAH 染色液成熟度较高，染色力稳定，保存时间较长，适合需要较长染色时间和较高重复性的组织学观察。

（3）该方法对横纹肌横纹、纤维蛋白、胞核、红细胞及神经胶质纤维着色较强，通常呈深蓝色；胶原纤维和软骨基质多呈棕红色；粗大弹性纤维可呈紫色，因此有利于不同组织成分的鉴别显示。

1.3 染色质量要求

（1）横纹肌横纹、纤维蛋白及神经胶质纤维着色清晰，呈深蓝色。

（2）胶原纤维和软骨基质呈棕红色，与深蓝色结构形成明确对比。

（3）切片背景较干净，组织轮廓完整，颜色层次分明。

2 材料与试剂

2.1 样本类型

（1）横纹肌相关组织石蜡切片。

（2）需观察炎症渗出中纤维蛋白沉积的组织切片。

（3）神经病理相关组织切片。

（4）需区分横纹肌横纹、胶原纤维及其他间质成分的常规组织切片。

2.2 主要试剂

（1）PTAH 氧化剂 A。

（2）PTAH 氧化剂 B。

（3）草酸溶液。

（4）Mallory PTAH 染色液（自然氧化法）。

（5）10% 福尔马林固定液。

（6）蒸馏水。

（7）系列乙醇。

（8）二甲苯或脱蜡透明液。

（9）中性树胶。

2.3 耗材与器材

（1）载玻片与盖玻片。

（2）染色缸。

（3）镊子、吸水纸。

（4）石蜡切片机。

（5）显微镜。

3 染液与样本准备

3.1 PTAH 氧化剂准备

（1）临用前取 PTAH 氧化剂 A 与 PTAH 氧化剂 B 等量混合。

（2）混合后即为 PTAH 氧化剂，应现配现用。

（3）配制后不宜长时间放置，以免氧化能力变化影响染色效果。

3.2 固定要求

（1）组织应固定于 10% 福尔马林溶液中。

（2）固定后按常规流程完成脱水和石蜡包埋。

（3）同批样本应尽量采用一致的固定条件，以减少染色差异。

3.3 切片与脱蜡要求

（1）石蜡切片厚度建议为 4 μm。

（2）切片附着应牢固，以避免长时间染色过程中脱片。

（3）石蜡切片应常规二甲苯或脱蜡透明液脱蜡至水。

（4）进入染色步骤前，切片应处于充分水化状态。

4 实验流程

4.1 固定与包埋

（1）组织固定于 10% 福尔马林溶液中。

（2）固定后按常规流程脱水、包埋。

4.2 切片与脱蜡

（1）石蜡切片厚 4 μm。

（2）常规二甲苯或脱蜡透明液脱蜡至水。

4.3 PTAH 氧化剂氧化

（1）将切片置于新配制好的 PTAH 氧化剂中。

（2）氧化 5 min。

（3）氧化后稍水洗，以去除表面残液。

4.4 草酸溶液漂白

（1）将切片置于草酸溶液中漂白 1～2 min。

（2）随后自来水冲洗 2 min。

（3）再用蒸馏水洗 1 次。

4.5 Mallory PTAH 染色

（1）将切片置于 Mallory PTAH 染色液中浸染。

（2）染色时宜加盖，以减少挥发和污染。

（3）染色时间为 24～48 h。

（4）该方法属于进行性染色，染色 24 h 后可先行镜下观察，再决定是否继续延长染色时间。

4.6 去除多余染液

（1）染色结束后取出切片。

（2）不得先用水洗。

（3）直接用 95% 乙醇迅速洗去多余染液。

（4）95% 乙醇洗涤时间不宜过长，以免已着染结构发生褪色。

4.7 脱水、透明与封片

（1）切片按常规流程继续脱水。

（2）转入二甲苯或脱蜡透明液中透明。

（3）滴加中性树胶，覆盖盖玻片，完成封片。

（4）封片后应避免产生气泡，并保持胶液分布均匀。

5 染色结果

5.1 深蓝色

（1）横纹肌的横纹。

（2）纤维蛋白。

（3）胞核。

（4）红细胞。

（5）神经胶质纤维。

5.2 棕红色

（1）胶原纤维。

（2）软骨基质。

5.3 紫色

（1）粗大的弹性纤维。

6 结果判读要点

6.1 横纹肌横纹判读

（1）横纹肌横纹呈深蓝色时，提示横纹结构显示良好。

（2）若胞质内可见清晰蓝色横纹结构，可提示相关细胞存在横纹肌分化特征。

（3）若横纹显示不清，应优先回查氧化步骤、染色时间及 95% 乙醇洗涤时间。

6.2 纤维蛋白判读

（1）炎症渗出中的纤维蛋白呈深蓝色时，有利于与周围结缔组织区分。

（2）血管内纤维蛋白沉积亦可表现为深蓝色，有助于识别异常沉积部位。

6.3 神经胶质纤维判读

（1）神经胶质纤维呈深蓝色时，有助于神经病理样本中相关结构的观察。

（2）判读时应结合组织背景和分布方式综合分析。

6.4 胶原纤维与软骨基质判读

（1）胶原纤维和软骨基质呈棕红色时，可与深蓝色横纹及纤维蛋白形成清晰对比。

（2）若间质成分过深或过浅，应综合考虑固定、氧化和染色时间等因素。

6.5 弹性纤维判读

（1）粗大弹性纤维呈紫色时，可作为背景组织中的辅助识别标志。

（2）该方法对弹性纤维并非最专一显示法，判读时应注意与其他间质成分区分。

7 常见问题与原因分析

7.1 横纹显示蓝色不足或横纹呈鲜红色

（1）PTAH 氧化时间不足。

（2）氧化剂状态不稳定或配制后放置时间过长。

（3）也可能存在过度氧化，应重新更换染液或新配氧化液后再试。

7.2 目标结构颜色变浅或染色被洗脱

（1）Mallory PTAH 染色后进行了水洗。

（2）95% 乙醇洗涤时间过长。

（3）脱水处理不当，导致已着染颜色部分流失。

7.3 切片整体着色过深

（1）染色时间过长。

（2）进行性染色过程中未及时进行镜下观察。

（3）未根据 24 h 后的着色程度调整后续染色时间。

7.4 切片发灰或透明度差

（1）脱水不充分。

（2）透明不足。

（3）封片前残留水分，影响镜下观察效果。

8 应用范围

8.1 横纹肌相关研究

（1）用于显示横纹肌横纹。

（2）适用于横纹肌分化相关组织的辅助观察。

8.2 纤维蛋白显示

（1）用于炎症渗出中纤维蛋白观察。

（2）用于毛细血管内纤维蛋白沉积观察。

8.3 神经病理相关研究

（1）用于神经胶质纤维显示。

（2）适用于中枢神经系统及相关组织结构观察。

8.4 结缔组织辅助鉴别

（1）用于观察胶原纤维和软骨基质。

（2）可作为组织学中多成分对比显示的补充方法。

9 安全与操作规范

9.1 个人防护

（1）实验过程中应穿实验服并佩戴一次性手套。

（2）处理固定液、乙醇、二甲苯及染色液时应在通风条件良好的环境下操作。

9.2 废液处理

（1）含固定液、乙醇、二甲苯及染色残液的废液应分类收集。

（2）所有废液与污染耗材应按实验室化学品处理规范处置。

10 Mallory磷钨酸苏木素法相关试剂选型

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[1] 组织学与细胞学切片染色：病理常规与结构特染的原理与方法学要点