1 概述

1.1 目的与适用范围

        本规程用于建立间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)体外成软骨微团诱导及阿利新蓝染色鉴定流程，适用于骨髓、脂肪和脐带等来源MSCs的成软骨分化研究。

1.2 方法原理

        高密度细胞微团培养可增强MSC间的细胞接触，并形成有利于软骨分化的三维环境。TGF-β3、地塞米松、ITS、抗坏血酸、丙酮酸钠和脯氨酸可促进软骨相关细胞外基质形成。

        阿利新蓝可与软骨基质中的酸性糖胺聚糖结合，使软骨样基质呈蓝色，用于评价蛋白聚糖沉积和成软骨分化效果。

2 材料与试剂

2.1 细胞

（1）骨髓来源MSCs。

（2）脂肪来源MSCs。

（3）脐带来源MSCs。

        建议使用生长状态良好、无支原体污染且分化潜能稳定的细胞。

2.2 主要试剂

（1）MSC完全培养基。

（2）高糖DMEM培养基。

（3）TGF-β3。

（4）地塞米松。

（5）胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂(ITS)。

（6）抗坏血酸。

（7）丙酮酸钠。

（8）L-脯氨酸。

（9）胰蛋白酶细胞消化液。

（10）PBS。

（11）中性福尔马林或其他适用固定液。

（12）石蜡包埋及切片试剂。

（13）阿利新蓝染色液。

2.3 成软骨诱导培养基

        以高糖DMEM为基础培养基，加入下列成分：

（1）TGF-β3，终浓度20ng/mL。

（2）地塞米松，终浓度100nM。

（3）ITS，终浓度1%。

（4）抗坏血酸，终浓度50μg/mL。

（5）丙酮酸钠，终浓度1mM。

（6）L-脯氨酸，终浓度40μg/mL。

        培养基宜现用现配或分装保存，避免反复冻融。

2.4 主要器材

（1）15mL无菌离心管。

（2）CO₂培养箱。

（3）倒置显微镜。

（4）离心机。

（5）细胞计数仪或血球计数板。

（6）石蜡包埋机和切片机。

3 实验分组

3.1 成软骨诱导组

        细胞使用成软骨诱导培养基进行微团培养。

3.2 未诱导对照组

        细胞使用不含TGF-β3、地塞米松、ITS、抗坏血酸、丙酮酸钠和脯氨酸的基础培养基培养。

3.3 重复设置

        每组建议至少设置3个独立细胞微团，并保证细胞来源、代次、起始细胞数和培养时间一致。

4 实验流程

4.1 细胞消化与收集

（1）选择融合度达到80%～90%的MSCs。

（2）弃去原培养基，以PBS轻洗细胞。

（3）加入适量胰蛋白酶细胞消化液。

（4）待细胞解离后，加入MSC完全培养基终止消化。

（5）轻柔吹打形成单细胞悬液。

（6）进行细胞计数并调整细胞浓度。

4.2 细胞微团制备

（1）每管取3×10⁵～4×10⁵个MSC，转移至15mL离心管。

（2）以200×g离心5min，使细胞在管底形成完整沉淀。

（3）吸弃上清，避免触碰或吹散细胞沉淀。

（4）沿离心管壁缓慢加入2mL成软骨诱导培养基。

（5）如细胞沉淀被吹散，应重新离心形成沉淀。

（6）将离心管盖适度旋松，保证气体交换。

（7）置于37℃、5% CO₂、饱和湿度培养箱中静置培养。

4.3 细胞微团培养

（1）静置培养24～48h。

（2）轻弹离心管底部，使形成的细胞微团脱离管底并悬浮于培养基中。

（3）沿管壁缓慢吸弃旧培养基，避免吸走或破坏细胞微团。

（4）加入2mL新鲜成软骨诱导培养基。

（5）此后每2～3d更换一次培养基。

（6）每日轻弹离心管底部1～2次，避免细胞微团持续黏附于管底。

（7）持续诱导14～24d。

4.4 诱导终点观察

        诱导过程中，细胞微团直径逐渐增加，表面趋于光滑并呈胶质样外观。当细胞微团直径达到约1.5～2mm时，可进行固定、包埋、切片和染色鉴定。

5 细胞微团固定与切片

5.1 细胞微团清洗

（1）收集细胞微团。

（2）以PBS轻柔清洗1～2次。

（3）清洗过程中避免反复吹打或挤压微团。

5.2 固定

（1）加入中性福尔马林或其他适用固定液，使其完全浸没细胞微团。

（2）按照所用固定液要求完成固定。

（3）固定后以PBS清洗。

5.3 石蜡包埋与切片

（1）按常规组织学流程进行脱水、透明和石蜡浸透。

（2）将细胞微团进行石蜡包埋。

（3）制备厚度一致的石蜡切片。

（4）切片经脱蜡和复水后进行阿利新蓝染色。

6 阿利新蓝染色

6.1 染色

（1）将脱蜡复水后的切片置于阿利新蓝染色液中。

（2）室温染色30min。

（3）以自来水流水冲洗2min。

（4）以蒸馏水冲洗约30s，终止染色。

（5）按照所用染色体系完成脱水、透明和封片。

（6）显微镜下观察并记录染色结果。

6.2 结果判读

        软骨样细胞外基质和酸性糖胺聚糖沉积区域呈蓝色或蓝绿色。成软骨诱导组染色范围和染色强度明显高于未诱导对照组，可支持成软骨分化成功。

7 关键控制点

7.1 起始细胞数量

        每个细胞微团的起始细胞数量应保持一致。细胞数量过少可能难以形成稳定微团，细胞数量过多可能导致微团中心缺氧或坏死。

7.2 细胞沉淀完整性

        首次加入诱导培养基时不得吹散细胞沉淀，否则会影响细胞微团形成。

7.3 换液操作

        换液时应沿离心管壁缓慢进行，避免吸走或机械损伤细胞微团。

7.4 培养时间

        培养时间不足可能导致软骨基质沉积较少；培养时间过长或细胞微团过大可能出现中心坏死。

7.5 染色判读

        阿利新蓝主要反映酸性糖胺聚糖沉积，宜结合番红O染色或SOX9、COL2A1和ACAN等软骨相关标志物进行综合评价。

8 常见问题与原因分析

8.1 不能形成完整细胞微团

（1）起始细胞数量不足。

（2）细胞活率较低。

（3）首次加入培养基时吹散了细胞沉淀。

（4）细胞状态或代次不适宜。

8.2 细胞微团形态不规则

（1）细胞微团持续黏附于管底。

（2）换液过程中受到机械损伤。

（3）各管起始细胞数量不一致。

8.3 阿利新蓝染色较弱

（1）诱导时间不足。

（2）TGF-β3或其他诱导成分活性降低。

（3）软骨样基质形成不足。

（4）切片处理或染色时间不一致。

8.4 细胞微团中心坏死

（1）起始细胞数量过多。

（2）细胞微团体积过大。

（3）培养基更换不及时。

（4）气体交换或营养扩散不足。

9 安全与废弃物处理

（1）实验过程中应穿实验服并佩戴一次性手套。

（2）固定液、脱蜡试剂和染色液应在通风良好的条件下操作。

（3）固定废液、染色废液及细胞培养废物应分类收集并按实验室规范处理。

10 间充质干细胞成软骨分化及阿利新蓝染色鉴定相关产品

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[2] 间充质干细胞（MSCs）鉴定