AF594 NHS 活化酯标记反应的推荐 pH 是多少？

适宜pH一般为8.0–8.5：pH过低反应缓慢，pH过高则NHS酯快速水解。常见做法是抗体先溶于pH 7.2–7.4的1× PBS，再加入少量1 M NaHCO₃或碳酸盐缓冲液，将体系pH调至约8.3。

高效标记所需的推荐抗体浓度是多少？

为获得良好标记效率，推荐抗体浓度范围2–10 mg/mL，低于1–2 mg/mL时偶联效率明显下降。

推荐的染料/抗体摩尔比和目标DOL是多少？

常用起始摩尔比为5–10 : 1（染料 : 抗体）。实验中可根据信号强度和抗体活性优化至合适DOL（一般推荐3–8）。

AF594 NHS活化酯应如何保存？

固体试剂建议-20 ℃、干燥、避光、密封条件下长期保存，避免频繁开盖吸潮。DMSO储备液（如10 mM）应分装后置-20 ℃避光保存，避免反复冻融，建议在1–2周内使用完毕。

如何用1 mg AF594 NHS活化酯配制10 mM DMSO储备液？

分子量为819.85 g/mol，1 mg约为1.22 µmol。为配制10 mM（0.01 mol/L）溶液，加入约120–125 µL无水DMSO。固体试剂回温至室温后开瓶，轻轻吹打或涡旋混匀至完全溶解，分装成若干小管（如10–20 µL/管），-20 ℃避光保存。

标记反应后如何去除游离AF594染料？

推荐使用脱盐柱（如Sephadex G-25或同类预装柱）：按说明书用1× PBS（pH 7.2–7.4）预平衡柱子，加载反应液，收集最先洗出的蛋白峰组分。备选方案是使用截断分子量10–20 kDa的透析袋，于4 ℃避光透析4–12 h，中间更换缓冲液2–3次。

如何计算AF594-抗体共轭物的标记度（DOL）？

测定纯化后共轭物在280 nm（A₂₈₀）和约590 nm（A₅₉₀）的吸光度。用厂家给出的修正系数CF₂₈₀（典型值约0.56，具体以COA为准）对A₂₈₀进行修正。再利用摩尔消光系数（ε_AF594 ≈ 92,000 L·mol⁻¹·cm⁻¹；ε_IgG,280 ≈ 203,000 L·mol⁻¹·cm⁻¹）分别估算染料和抗体浓度，计算DOL。一般推荐DOL为3–8。

AF594标记抗体可以用于多色实验吗？

可以。AF594与561 nm / 594 nm等常用激光线兼容，可与AF488、Aladdin Fluor 568、AF647等染料组合用于多色实验。

AF594标记抗体共轭物的储存建议是什么？

可在PBS中加入适量甘油（如50% v/v）和防腐剂（如0.02%叠氮钠，视后续用途而定）。4 ℃短期保存，-20 ℃或以下长期保存，避免反复冻融。

实验方案（Protocols）

AF594 NHS活化酯用于抗体荧光标记的操作指南

Q: 使用AF594 NHS活化酯时应避免哪些缓冲液？

应避免含Tris、glycine等带伯胺的缓冲液，以及高浓度硫酸铵、乙酸铵等铵盐，它们会与NHS酯竞争反应。

· · 发布于 2025年12月4日 · 更新于 2025年12月4日 ·

AF594 NHS 活化酯产品概述

AF594 NHS 活化酯（Alexa Fluor 594 NHS Ester / AF594 NHS Ester）是一种红区荧光染料的活性酯形式，可在温和弱碱性条件下与蛋白质、抗体、多肽等分子上的伯胺（–NH₂）发生反应，形成稳定酰胺键，是常用的蛋白/抗体荧光标记试剂。

基本信息：

(1) 产品名称： AF594 NHS 活化酯

(2) 英文名称： Alexa Fluor 594 NHS Ester / AF594 NHS Ester

(3) CAS 号： 295348-87-7

(4) 分子式： C₃₉H₃₇N₃O₁₃S₂

(5) 分子量： 819.85 Da

(6) 外观： 蓝紫色至紫红色固体粉末

(7) 光谱性质： 激发峰约590 nm，发射峰约617 nm，呈橙红色荧光

(8) pH 适用范围： 在pH 4–10范围内荧光信号基本不受pH变化影响

主要特点：

(1) 亮度高、光稳定性好，适合细胞成像、流式细胞术、免疫荧光、ELISA等应用；

(2) 染料磺化结构带来良好亲水性及较低非特异结合，可在较高染料/蛋白比下标记而不过度自猝灭；

(3) 与561 nm / 594 nm等常用激光线兼容，便于多色联合使用。

存储与使用建议：

· 固体试剂：

(1) 建议-20 ℃、干燥、避光、密封条件下长期保存，避免频繁开盖吸潮。

· DMSO储备液：

(2) 推荐用无水DMSO配制高浓度储备液（如 10 mM）；

(3) 分装小管后置-20 ℃避光保存，避免反复冻融；

(4) 建议在1–2周内使用完毕，以保证活性。

提示：AF594 NHS活化酯易被水解失活，所有溶液配制和标记操作应尽量快速、避光完成。

抗体标记的基本原则

使用AF594 NHS活化酯标记抗体时，建议遵循以下原则：

1. 反应 pH：

(a) 适宜pH一般为8.0–8.5：pH过低反应缓慢，pH过高则NHS酯快速水解。

(b) 常见做法：抗体先溶于pH 7.2–7.4 的1× PBS，再加入少量1 M NaHCO₃ 或碳酸盐缓冲液，将体系 pH 调至约 8.3。

2. 缓冲体系：

(a) 推荐：1× PBS（pH 7.2–7.4） + 适量碳酸氢钠或碳酸盐缓冲液升pH；

(b) 避免：含Tris、glycine等带伯胺的缓冲液，以及高浓度硫酸铵、乙酸铵等铵盐，它们会与NHS酯竞争反应。

3. 抗体制剂要求：

(a) 尽量使用不含BSA、明胶等蛋白稳定剂的抗体制剂；

(b) 避免含有叠氮钠、硫柳汞等防腐剂，必要时通过透析或脱盐柱脱除；

4. 染料/抗体摩尔比（Dye/Protein）：

(a) 常用起始摩尔比为5–10 : 1（染料 : 抗体）；

(b) 实验中可根据信号强度和抗体活性优化至合适DOL（一般推荐3–8）。

5. 反应条件：

(a) 通常在室温（20–25 ℃）下轻柔混匀反应30–60 min；

(b) 全程避光操作。

AF594 DMSO储备液的配制示例

以配制10 mM DMSO储备液为例，假设一次称取1 mg AF594 NHS活化酯：

(1) 分子量：819.85 g/mol

(2) 物质的量：

(3) 为制备10 mM（0.01 mol/L）溶液，需要体积：

操作建议：

1. 固体试剂回温至室温后开瓶；

2. 加入约120–125 µL无水DMSO，轻轻吹打或涡旋混匀至完全溶解；

3. 分装成若干小管（如 10–20 µL/管），-20 ℃避光保存。

山羊抗小鼠IgG与AF594 NHS活化酯标记示例方案

以下以1 mg山羊抗小鼠IgG为例，可按比例放大或缩小。

1 抗体溶液准备（溶液A）

1. 确保山羊抗小鼠IgG溶解在1× PBS（pH 7.2–7.4）中，且不含BSA/明胶/Tris/甘氨酸等成分；

2. 调整抗体浓度至1 mg/mL，取1.0 mL（即含1 mg 抗体）至1.5 mL离心管；

3. 加入100 µL 1 M NaHCO₃（pH 8.3–8.5），混匀，使体系pH升至约8.3。

(a) 此时体积约为1.1 mL，抗体浓度略降，但仍适合标记。

IgG分子量约150 kDa

1 mg 抗体的物质的量约为：

2 染料储备液（溶液 B）

(a) 使用前从-20 ℃取出一支10 mM AF594 DMSO储备液分装管，室温短暂回温至完全融解；

(b) 使用后立刻放回-20 ℃保存。

3 染料用量计算与加样

以10倍摩尔过量染料为起始条件：

(a) 抗体量：约6.7 nmol

(b) 染料量（10×）：约67 nmol

操作：

1. 向上述1.1 mL 抗体溶液（溶液 A）中加入约6.7 µL 10 mM AF594 DMSO溶液；

2. 轻轻吹打或短暂涡旋混匀，避免剧烈震荡起泡。

为优化条件，可并行设置例如 5×、10×、15× 染料过量组：

(A) 5×：约 3.3 µL（10 mM）

(B) 10×：约 6.7 µL（10 mM）

4 共轭反应

1. 将反应混合液置于室温（20–25 ℃）；

2. 轻柔摇床或旋转孵育30–60 min；

3. 全程避光（可用锡箔纸包裹离心管）；

4. 反应结束后立即进行纯化去除游离染料。

共轭物的纯化：去除游离AF594

为降低背景并提高标记一致性，建议在反应结束后去除游离AF594染料。

1 使用脱盐柱（推荐）

可选用Sephadex G-25或同类预装脱盐柱/离心柱：

1. 按说明书用1× PBS（pH 7.2–7.4）预平衡柱子；

2. 将标记反应液（约1.1 mL）加载至柱上；

3. 再加入适量PBS洗脱，收集最先洗出的淡黄色/蛋白峰组分（通常为标记抗体）；

4. 可简单测定其和，确认蛋白与染料均存在且游离染料峰已明显减少。

2 使用透析袋（备选）

如暂时无脱盐柱，可采用透析法：

1. 选用截断分子量10–20 kDa的透析袋；

2. 将反应液装入透析袋，外相使用大量1× PBS（pH 7.4）；

3. 4 ℃避光透析4–12 h，中间更换缓冲液2–3次；

4. 透析后得到的溶液即为去除大部分游离染料的AF594标记抗体。

纯化后的共轭物可用于细胞染色、流式细胞术或免疫检测等实验。

标记度（DOL）的简要评估

对于需要更精确控制标记程度的用户，可通过吸收光谱估算染料/抗体的标记度DOL（degree of labeling）。一般推荐抗体DOL约3–8。

简单思路：

1. 测定纯化后的共轭物在：

(a) 280 nm（蛋白吸收峰）的吸光度；

(b) 约590 nm（AF594最大吸收峰附近）的吸光度。

2. 考虑AF594在280 nm也有吸收，可用厂家给出的修正系数（典型值约为0.56,具体以本品COA为准）进行修正,注：不同厂家/异构体的AF594具体CF₂₈₀ 可能略有差异，请以当前批次COA中给出的数值为准：

3. 利用已知摩尔消光系数估算浓度：

(a) AF594在最大吸收波长的摩尔消光系数 ε_AF594 ≈ 92,000 L·mol⁻¹·cm⁻¹；

(b) IgG 在 280 nm 的摩尔消光系数 ε_IgG,280 ≈ 203,000 L·mol⁻¹·cm⁻¹。

则有：

4. 标记度DOL估算为：

若仅用于常规定性或半定量检测，且用推荐条件得到的信号强度和抗体活性满意，用户可不必每次都进行DOL计算；对于对批次间一致性要求较高的应用（如商品化抗体、定量检测），建议常规评估DOL。

注意事项与合规声明

1. AF594 NHS 活化酯及其标记抗体仅限科学研究或工业用途，不得用于人体或动物临床诊断、治疗，不得作为药物或食品添加剂；

2. 操作时应佩戴适当的个人防护装备（手套、护目镜等），避免皮肤和眼睛接触；

3. 共轭物储存建议：

(a) 可在PBS中加入适量甘油（如 50% v/v）和防腐剂（如 0.02% 叠氮钠，视后续用途而定）；

(b) 4 ℃短期保存，-20 ℃或以下长期保存，避免反复冻融；

4. 实际使用时，请结合阿拉丁该批次产品的COA（质量证明书）和MSDS获取更详细的安全与操作信息。

AF594抗体标记方案中涉及的主要化学品一览（含AF系列多色染料）

品名 / 英文名	阿拉丁货号	级别/纯度	CAS 号	在本实验及相关应用中的作用 / 用途
AF594 NHS 活化酯 Alexa Fluor 594 NHS Ester / AF594 NHS ester	C378964	≥95%	295348-87-7	本方案的核心荧光染料：红色磺化罗丹明类 NHS 活化酯，可在 pH 8 左右与抗体/蛋白上的伯胺反应形成稳定酰胺键，用于制备 AF594 标记抗体和蛋白。Ex/Em 约 590/610–617 nm，pH 4–10 范围内信号稳定，亮度高、光稳定性好。
AF488 NHS 活化酯 AF488 NHS ester / Alexa Fluor 488 NHS Ester	A684772	-	1374019-99-4	绿色通道AF染料，作为FITC的高亮度替代。NHS 活化酯可标记蛋白、抗体、寡核苷酸等伯胺。典型 Ex/Em ≈ 495/519 nm，水溶性好，在 pH 4–10 范围内荧光基本不受影响，适合细胞成像与流式检测。
Aladdin® 488 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）	A598198	≥80%(HPLC)	1374019-99-4(free base)	绿色通道荧光标记染料，对应 488 nm 激光；NHS 活化酯可与抗体/蛋白伯胺共价偶联，制备 488 通道标记抗体，适合作为 FITC 的高亮度替代，并与 AF594、Aladdin Fluor 568、AF647 等多色搭配使用。
Aladdin Fluor 568 NHS Ester（AF568 等效染料）	A638820	Ex:579nm Em:603nm	-	橙红色 AF 染料，适合作为 AF488 与 AF594/AF647 之间的中间波长通道。用于蛋白/抗体等伯胺的共价标记，典型 Ex/Em ≈ 578/602–603 nm，亮度高、光稳定性好，pH 4–10 信号稳定。
AF647 NHS 活化酯 Alexa Fluor 647 NHS Ester / AF647 NHS ester	A1454424	-	1620475-28-6	远红/近红外 AF 染料，Cy5 的理想替代。NHS 酯可标记蛋白、抗体和含胺小分子。典型 Ex/Em ≈ 650/665–668 nm，背景低、信噪比高，适合多色配对、深层成像、自发荧光较高样本。
二甲基亚砜（DMSO） Dimethyl sulfoxide	D433293	无水级 ≥99.9%	67-68-5	作为无水有机溶剂用于溶解 AF594 / AF488 / AF568 / AF647 等 NHS 活化酯，配制 10 mM 等高浓度储备液；储备液可 -20 ℃ 避光短期保存，用于后续标记反应。
碳酸氢钠 Sodium bicarbonate	S112331	AR ≥99.8%	144-55-8	配制 1 M NaHCO₃ 或碳酸氢钠缓冲液（pH 8.3–8.5），用来将抗体溶液的 pH 从 7.2–7.4 提升到 8.0–8.5，以利于 NHS 酯与抗体赖氨酸残基的伯胺高效偶联。也可作为标记反应缓冲液的一部分。
PBS 磷酸盐缓冲盐溶液（1×） Phosphate Buffered Saline	P301982	1×,pH7.2-7.4,,粉剂,不含Ca2+/Mg2+	混合物（无单一 CAS）	作为抗体溶液、透析和纯化的基础缓冲体系。pH 通常为 7.2–7.4，用于保持抗体构象稳定；同时可作为脱盐柱的平衡/洗脱缓冲液，去除游离染料后得到 AF 标记抗体。
磷酸氢二钾 Potassium phosphate dibasic, K₂HPO₄	P112214	AR ≥99%	7758-11-4	若选择自配 PBS，可与 NaH₂PO₄ 或 KH₂PO₄ 搭配组成 PBS 的磷酸盐缓冲体系，用于调节和维持 pH 7.2–7.4。
磷酸二氢钠 Sodium dihydrogen phosphate, NaH₂PO₄	S108339	AR ≥99%	7558-80-7	自配 PBS 时的单碱式钠盐成分，与 K₂HPO₄ 配比使用以调节 PBS 的 pH 和缓冲能力。
磷酸二氢钾 Potassium dihydrogen phosphate, KH₂PO₄	P104075	AR ≥99.5%	7778-77-0	自配 PBS 的另一种常用磷酸盐成分，可与 Na₂HPO₄ 或 K₂HPO₄ 组合，形成 Na⁺/K⁺ 混合 PBS 缓冲体系。
甘油 Glycerol	G116208	分子生物学级 ≥99%	56-81-5	用于 AF 标记抗体的长期储存稳定剂，常配制成含 25–50% (v/v) 甘油的 PBS 缓冲液，降低冻融损伤、提高低温（-20 ℃ 或以下）保存稳定性。

阿拉丁：https://www.aladdin-e.com/

目录：实验方案（Protocols）

探索主题： AF594 NHS活化酯

Da — 若无特别说明，分子量单位默认为道尔顿。 Mw — 重均分子量。 Mn — 数均分子量。

产品仅供科研与开发使用，不用于人体、动物、诊断或治疗。

引用本文

阿拉丁科学.《AF594 NHS活化酯用于抗体荧光标记的操作指南》. 阿拉丁知识库，更新于 2025年12月4日。
                            https://www.aladdin-e.com/zh_cn/faqs/operational-guide-for-fluorescent-labeling-of-antibodies-using-af594-nhs-ester.html

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