1 概述

1.1 目的与适用范围

        本规程用于建立磷钨酸负染色法的常规操作流程，适用于透射电镜下病毒、噬菌体、外泌体、脂质体、蛋白质复合物、核糖体、核酸-蛋白复合物、细菌鞭毛/菌毛及纳米颗粒的负染观察，也可用于部分分离纯化细胞器的快速形态评估。

1.2 方法原理

（1）负染色利用磷钨酸等高电子密度重金属盐包绕样品，使背景在电子束照射下呈现较高电子散射和较深色调。

（2）目的样品本身通常不被染色剂充分穿透，电子密度相对较低，因此在暗色背景中表现为明亮轮廓或电子透明结构。

（3）该方法主要用于快速显示颗粒大小、外形边界、表面轮廓及部分内部对比，不适合作为超微结构精细分辨的唯一依据。

1.3 方法特点

（1）操作简便，成像对比明显。

（2）适合低倍至中高倍下快速筛查样品质量与分散状态。

（3）对样品纯度、盐离子背景、pH 及干燥过程较为敏感。

2 材料与试剂

2.1 样本类型

（1）病毒悬液。

（2）外泌体或细胞外囊泡悬液。

（3）蛋白质复合物悬液。

（4）脂质体、纳米颗粒或其他微纳结构悬液。

2.2 主要试剂

（1）2% 磷钨酸负染色液。

（2）去离子水或蒸馏水。

（3）必要时使用的预固定液，如戊二醛或四氧化锇。

2.3 耗材与器材

（1）带支持膜的铜网或载网。

（2）滤纸条或吸水纸。

（3）移液器及配套吸头。

（4）镊子。

（5）蜡膜或封口膜。

（6）离心机。

（7）透射电镜。

3 样本与染色液准备

3.1 样本要求

（1）样品应尽量新鲜，避免反复冻融。

（2）样品应分散均匀，避免明显聚集和沉淀。

（3）样品纯度和浓度应适宜，过多盐离子、糖类或杂质蛋白会影响负染色铺展和背景质量。

3.2 染色液要求

（1）负染色液常用终浓度为 2%。

（2）磷钨酸染色效果受 pH 影响较大，通常 pH 6.0～7.0 条件下综合色差较稳定。

（3）若样品对酸碱较敏感，应先进行小规模条件摸索。

3.3 载网准备

（1）载网应洁净、完整，支持膜无明显破损。

（2）操作时应确认膜面方向，避免翻转污染。

（3）如采用碳膜铜网，应用镊子轻夹边缘，避免损伤膜面。

4 实验流程

4.1 滴染法

（1）样品准备：样品需分散均匀。必要时可先进行低速离心（2,000 × g，10 min）以去除大颗粒杂质或明显沉淀；若样品浓度不足，可根据样品类型采用其他适宜方法浓缩样品，制成悬浮液并使其达到适宜浓度和纯度。

（2）上样：将载网膜面朝上置于干净的蜡膜或封口膜上，滴加 10～20 μL 样品悬浮液，室温静置 3～5 min，使样品吸附于支持膜表面。

（3）清洗：若样品中含有较高盐分或缓冲液成分，可在吸去样液后滴加一滴去离子水进行快速清洗。清洗步骤应尽量简短，避免样品流失。

（4）染色：用滤纸条从载网边缘轻轻吸去多余液体后，立即滴加 1 滴约 10 μL 磷钨酸负染色液，静置 1～2 min。

（5）干燥：用滤纸条从载网边缘轻轻吸干多余染液，室温自然晾干后即可进行透射电镜观察。

4.2 漂浮法

（1）样品制备：必要时可先将样品低速离心（2,000 × g，10 min），以去除大颗粒杂质或明显沉淀；也可根据样品类型采用其他适宜方法浓缩样品，制成均匀悬浮液，并使其达到适宜浓度和纯度。

（2）吸附：将带有支持膜的载网置于样品液滴上漂浮，支持膜面朝下，使样品沾取并吸附于膜面。

（3）染色：将载网转移至负染色液液滴表面漂浮 1～2 min。

（4）干燥：取出载网后吸去多余染色液，室温自然干燥后进行透射电镜观察。

5 预固定与特殊处理

5.1 敏感样品处理

（1）部分对表面张力敏感的样品在自然干燥过程中可能发生塌陷、变形或断裂。

（2）对于此类样品，可在样品吸附后进行轻度预固定。

5.2 预固定建议

（1）可选用戊二醛或四氧化锇进行短时间预固定。

（2）预固定条件应根据样品类型单独优化，避免过度交联影响负染色效果。

6 染色结果

6.1 目的样品

（1）在透射电镜下多表现为电子透明或较亮轮廓。

（2）颗粒边界清晰时，可见较完整的外形和局部细微结构。

6.2 背景

（1）背景通常呈深灰色或黑色。

（2）背景均匀时，有利于样品边缘与结构识别。

7 结果判读要点

7.1 形态判读

（1）目的颗粒应具有较完整轮廓，边界清楚，分散较均匀。

（2）如出现明显塌陷、破裂或边缘模糊，应结合干燥损伤和染色条件综合判断。

7.2 背景判读

（1）背景均匀致密时，通常提示染色液铺展较好。

（2）若背景出现大面积结晶、颗粒杂乱或局部沉积，通常提示盐分、糖类或染液状态存在干扰。

7.3 样品纯度判读

（1）若视野中非目标颗粒较多，背景蛋白团块明显，提示样品纯化程度不足。

（2）外泌体、病毒或蛋白复合物样本在负染色前宜尽量降低盐分和杂质蛋白含量。

8 常见问题与原因分析

8.1 背景晶体过多

（1）样品中盐浓度过高。

（2）样品含较多磷酸盐或糖类成分。

（3）清洗步骤不足或缓冲体系不适合直接负染。

8.2 样品轮廓模糊

（1）样品浓度过低。

（2）吸附时间不足。

（3）染色时间过长或染液铺展不均。

8.3 样品聚集成团

（1）样品分散不充分。

（2）样品纯度不足。

（3）浓度过高或载网表面局部液体蒸发过快。

8.4 样品结构损伤

（1）自然干燥时表面张力过强。

（2）样品本身较脆弱，对 pH 或重金属盐敏感。

（3）必要时应考虑加入预固定步骤并重新优化染色条件。

9 应用范围

9.1 病毒与噬菌体观察

（1）用于病毒颗粒和噬菌体的快速筛查与形态评估。

（2）适合观察颗粒大小、外形边界及整体分散状态。

9.2 外泌体及囊泡样颗粒观察

（1）用于外泌体、脂质体及其他囊泡样纳米颗粒的轮廓显示。

（2）适合进行样品质量初筛和制备条件比较。

9.3 生物大分子与复合物观察

（1）用于蛋白质复合物、核糖体、核酸-蛋白复合物及纤维状大分子的负染观察。

（2）适合判断聚集状态、分散性和整体形态。

9.4 细菌附属结构与细胞器观察

（1）用于细菌鞭毛、菌毛等细长表面结构的轮廓显示。

（2）对部分分离纯化后的细胞器可进行快速形态评估。

10 安全与操作规范

10.1 个人防护

（1）实验过程中应穿实验服、佩戴口罩及一次性手套。

（2）涉及病毒样本或高风险生物样本时，应遵循相应生物安全等级要求。

10.2 试剂安全

（1）磷钨酸具有一定腐蚀性和重金属毒性。

（2）操作时应避免直接接触皮肤和眼睛，并在通风良好条件下进行。

10.3 废弃物处理

（1）含磷钨酸废液应按重金属相关化学废液分类收集。

（2）样品残液、污染滤纸和载网等应按实验室生物及化学污染物处理规范处置。

11 相关试剂与材料选型

表1 磷钨酸负染色相关试剂与材料选型