引言

        未知糖苷的完整结构包含多个层级的信息，包括分子式、苷元结构、糖的种类和数量、糖与苷元的连接位置、糖链连接顺序以及端基构型。高分辨质谱提供元素组成信息，化学水解和单糖分析确定组成单元，核磁共振建立原子之间的连接关系并提供立体化学信息。不同实验结果共同限定最终结构。

        Amakura等从麻黄提取物中分离得到一个新的黄酮糖苷。该化合物的结构研究包括高分辨电喷雾质谱、酸水解、单糖绝对构型分析以及一维和二维核磁共振。最终结构中的苷元、两个组成糖、糖—苷元连接位置、糖—糖连接位置和两个端基构型分别具有对应的实验依据[1]。

1 HRMS与MS/MS提供分子组成和碎片信息

1.1 从实测离子到分子式

        质谱测量的是带电粒子的质荷比（m/z）。电喷雾电离过程中，天然产物可以形成质子化离子、去质子化离子及金属离子加合物，例如[M+H]⁺、[M−H]⁻和[M+Na]⁺。离子形式决定实测m/z与中性分子质量之间的关系。

        Amakura等分离得到的未知黄酮糖苷在负离子模式高分辨电喷雾质谱（high-resolution electrospray ionization mass spectrometry，HR-ESI-MS）中出现：

m/z 609.1466 [M−H]⁻

作者计算的理论值为：

m/z 609.1461

对应中性分子式：

C₂₇H₃₀O₁₆

¹³C核磁共振谱同时给出与27个碳原子相符的碳信号，支持该分子式[1]。

        高分辨准确质量可以显著缩小元素组成范围。同一准确质量范围内仍可能存在多个元素组成候选，同位素分布、允许的元素种类、元素比例、化学价关系以及其他独立谱学信息可以进一步筛选分子式。Kind和Fiehn的系统研究显示，即使质量误差低于1 ppm，单独使用准确质量也可能得到多个符合条件的元素组成[2,3]。

        分子式C₂₇H₃₀O₁₆描述了整个分子的元素组成。苷元骨架、羟基取代位置、糖的具体种类、糖链连接方式以及立体构型属于进一步的结构信息。

1.2 MS/MS中的糖残基信息

        串联质谱（tandem mass spectrometry，MS/MS）选择特定前体离子并诱导其碎裂，通过产物离子的质量和元素组成获得局部结构信息。

        黄酮O-糖苷在碰撞诱导解离（collision-induced dissociation，CID）过程中常发生糖苷连接裂解。例如，在结构背景与碎裂途径相符时，约 162 Da 的中性丢失可支持存在元素组成为C₆H₁₀O₅的己糖基（hexosyl）残基。

        葡萄糖（glucose）、半乳糖（galactose）和甘露糖等醛己糖形成糖苷后，其糖基残基具有相同的名义质量贡献。因此，162 Da质量损失提供己糖基残基层面的信息；具体单糖种类由单糖分析、标准品比较或其他独立结构证据进一步确定。

        二糖和多糖链还可产生连续糖残基损失、内部单糖残基损失及不同丰度的糖苷键裂解产物。Ma等研究四对异构黄酮O-二糖苷时发现，内部单糖残基损失及糖苷键断裂形成的Y型产物离子（Y-type ions）能够反映糖链连接类型[4]。

1.3 糖间连接方式影响MS/MS碎裂

由鼠李糖和葡萄糖组成的二糖链中，两种常见连接形式为：

α-L-鼠李糖基-(1→2)-D-葡萄糖基

α-L-鼠李糖基-(1→6)-D-葡萄糖基

前一种对应新橙皮糖（neohesperidose）结构，后一种对应芸香糖（rutinose）结构。

        Ma等在所研究的黄酮O-二糖苷中发现，内部单糖残基损失及Y型离子的相对丰度能够区分1→2和1→6连接的异构体[4]。Cuyckens等采用正、负离子纳升电喷雾离子阱质谱研究同类黄酮O-二糖苷，也观察到两种糖间连接具有不同的碎裂特征；离子模式和苷元结构会影响产物离子的相对丰度[5]。

        MS/MS碎片的质量差还对应具体的断键过程。Shi等研究柑橘属黄酮O-二糖苷时发现，柚皮苷（naringin）的[M−H−120]⁻离子曾被归属于糖链碎裂，而正交飞行时间质谱的准确质量数据表明，该产物来自黄酮C环的逆Diels–Alder（retro-Diels–Alder，RDA）裂解[6]。

        产物离子的准确质量、元素组成、前体结构和碎裂反应共同限定碎片来源。MS/MS可以提供糖残基组成、部分糖链顺序和特定体系中的连接类型信息；具体连接碳位点由核磁共振等结构证据确定。

2 水解与单糖分析确定组成单元

2.1 酸水解确定苷元

        糖苷键裂解后释放的非糖部分可以独立进行色谱和光谱分析。Amakura等取1.5 mg未知糖苷，以0.5 mL、0.1 mol/L盐酸处理，在沸水浴中加热5 h。反应液冷却后经C18固相萃取处理，甲醇洗脱部分采用反相高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）分析。

        水解产物中检出保留时间为 27.3 min 的草质素（herbacetin），并与草质素对照品进行共色谱确认[1]。

该水解实验建立了未知糖苷与草质素之间的组成关系：

未知糖苷 → 酸水解 → 草质素

草质素由此确定为该糖苷的苷元。

酸水解所得苷元对应特定水解条件下最终检出的非糖部分。具有酸敏感结构的天然产物还可能在水解过程中发生进一步反应，具体水解条件和苷元对照品共同构成苷元鉴定的实验背景。

2.2 单糖种类和D/L构型系列

        糖苷水解同时释放组成糖。同一种单糖的D型和L型互为对映体，将游离糖与手性试剂反应形成非对映衍生物后，可利用普通反相色谱分离其衍生物。

        Tanaka等建立的反相HPLC方法使用L-半胱氨酸甲酯（L-cysteine methyl ester）和邻甲苯基异硫氰酸酯（o-tolyl isothiocyanate）对醛糖（aldose）进行衍生化。形成的非对映衍生物可在C18反相色谱柱上分离，并通过紫外检测区分多种D型和L型醛糖[7]。原研究验证了葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖和木糖等醛糖；果糖等酮糖（ketose）在该实验条件下未得到适用于此方法的分析峰。

        Amakura等采用这一方法分析未知糖苷的组成糖。1.0 mg样品用0.2 mL、0.5 mol/L盐酸加热水解，经强碱性阴离子交换树脂中和并蒸干后，与L-半胱氨酸甲酯盐酸盐在吡啶中60 ℃反应1 h，再加入邻甲苯基异硫氰酸酯，于60 ℃继续反应1 h。反应液进行反相HPLC分析，所得色谱峰分别与同法制备的D-葡萄糖和L-鼠李糖标准衍生物一致[1]。

组成糖确定为：

D-葡萄糖（D-glucose）

L-鼠李糖（L-rhamnose）

D/L表示组成糖所属的构型系列。在单糖种类已经确定的前提下，D/L判定可确定其对应对映体的绝对构型。完整糖苷中端基碳的α/β构型属于另一项立体化学信息，由完整分子的核磁共振数据确定。

2.3 水解得到糖苷的组成单元

酸水解及单糖分析确定了三个组成单元：

草质素

D-葡萄糖

L-鼠李糖

完整糖苷中的糖—苷元连接位置、鼠李糖与葡萄糖之间的连接位置以及两个糖残基的端基构型保留在未水解分子的核磁共振信号和核间相关关系中。

3 核磁共振建立苷元和糖的结构单元

3.1 草质素骨架的核磁共振信号

        质子核磁共振（¹H NMR）和碳-13核磁共振（¹³C NMR）反映分子中氢、碳原子的化学环境。质子—质子相关谱（correlation spectroscopy，COSY）建立同一自旋体系中质子之间的耦合关系，异核单量子相关谱（heteronuclear single quantum coherence，HSQC）将质子与直接相连的碳原子对应起来。

未知糖苷的¹H NMR中出现两组各含2个质子的芳香双峰：

δH 6.90，2H，d，J = 9.0 Hz

δH 8.20，2H，d，J = 9.0 Hz

另有：

δH 6.62，1H，s

两组双峰形成对位二取代苯环常见的A₂B₂型质子体系。¹³C NMR中可归属出15个黄酮骨架的sp²碳。原始研究据这些谱学特征提出草质素型黄酮骨架，酸水解所得草质素对照品结果进一步确认苷元身份[1]。

3.2 两个糖残基的核磁共振信号

¹H NMR中存在两个糖端基质子：

δH 5.20，1H，d，J = 7.5 Hz

δH 5.29，1H，d，J = 1.5 Hz

同时观察到：

δH 1.90，3H，d，J = 6.0 Hz

以及δH 3.3～3.9范围内主要相互重叠的糖区质子信号。δH 1.90的甲基双峰与鼠李糖C-6甲基的结构特征相符[1]。

¹³C NMR中的关键糖碳信号包括：

· 葡萄糖C-1：δC 101.3

· 葡萄糖C-2：δC 80.5

· 鼠李糖C-1：δC 102.9

· 鼠李糖C-6：δC 17.8

        两个端基质子、两组糖碳信号和鼠李糖甲基信号与水解后检出的D-葡萄糖和L-鼠李糖组成一致。COSY和HSQC进一步建立糖环内部的质子耦合关系以及直接相连的¹H—¹³C对应关系。

        糖的化学位移和耦合常数受到糖种类、环型、取代位置和构象影响。Roslund等对D-吡喃葡萄糖及D-葡萄糖基-D-葡萄糖苷的系统研究显示，糖间连接位置会改变相应¹H、¹³C化学位移和质子耦合参数[9]。

4 HMBC确定糖与苷元及糖与糖的连接位置

        异核多键相关谱（heteronuclear multiple bond correlation，HMBC）提供长程¹H—¹³C相关信息，其经典实验主要用于检测跨越两个或三个化学键的异核连接[8]。完成¹H和¹³C信号归属后，糖端基质子与另一结构单元特定碳之间的HMBC相关可直接建立结构单元之间的连接约束。

4.1 葡萄糖连接于草质素C-7

未知糖苷的HMBC谱中观察到：

葡萄糖H-1（δH 5.20） ↔ 草质素C-7（δC 151.9）的长程相关[1]。

葡萄糖H-1已经由糖区信号归属确定，δC 151.9归属于草质素C-7。该长程相关建立葡萄糖端基与草质素C-7位氧取代基之间的连接，糖—苷元部分确定为：草质素7-O-葡萄糖苷

4.2 鼠李糖连接于葡萄糖C-2

第二条关键HMBC相关为：

鼠李糖H-1（δH 5.29） ↔ 葡萄糖C-2（δC 80.5）[1]。

该相关建立鼠李糖端基与葡萄糖C-2之间的连接，因此糖间连接关系为：

鼠李糖基-(1→2)-葡萄糖基

其中“1”对应鼠李糖的端基碳C-1，“2”对应葡萄糖的C-2。葡萄糖C-2的δC 80.5也与该位置处于糖基化取代环境相符。

两条HMBC相关共同建立完整的连接骨架：

鼠李糖基-(1→2)-葡萄糖基-O-7-草质素

鼠李糖基-(1→2)-葡萄糖基对应新橙皮糖结构。MS/MS方法学研究在部分黄酮O-二糖苷体系中也观察到1→2和1→6连接具有不同的碎裂模式；该化合物中的具体C-2连接由HMBC长程相关确定[1,4,5]。

5 端基构型的确定

D/L构型系列和α/β端基构型描述糖残基的不同立体化学层级。单糖分析已经确定两个组成糖分别为D-葡萄糖和L-鼠李糖；完整糖苷中的端基构型由其核磁共振特征进一步确定。

5.1 D-葡萄糖残基的β构型

葡萄糖端基质子为：

δH 5.20，d，J = 7.5 Hz

邻位质子之间的三键耦合常数³J₁,₂与H-1/H-2之间的二面角和糖环构象相关。D-吡喃葡萄糖基在常见椅式构象中，β端基的H-1与H-2具有相应的空间取向，可表现出较大的邻位耦合常数。糖类核磁共振研究也显示，质子耦合参数与糖环几何和构象具有明确关系[9,10]。

结合已经确定的D-葡萄糖身份和完整糖区谱学归属，原始研究将J = 7.5 Hz的端基信号归属于：

β-D-吡喃葡萄糖基[1]。

5.2 L-鼠李糖残基的α构型

鼠李糖端基质子为：

δH 5.29，d，J = 1.5 Hz

单糖分析已经确定其为L-鼠李糖。在该化合物完整糖区信号归属的基础上，原始研究依据端基质子的耦合特征将鼠李糖残基确定为：

α-L-吡喃鼠李糖基[1]。

两个糖残基的完整立体化学和连接关系由此表示为：

α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基：

即新橙皮糖基。

端基耦合常数的解释与具体糖种、环型和构象相联系。不同糖类具有各自的耦合网络和构象特征，端基构型的指认建立在已经确定的糖身份和完整核磁共振归属基础上。

6 完整结构的证据对应关系

各项实验结果对应的结构信息如下：

小结

        未知糖苷的结构由分子组成、组成单元、原子连接和立体构型共同定义。高分辨质谱限定元素组成，水解和单糖分析确定苷元及组成糖，一维和二维核磁共振建立各结构单元的信号归属，HMBC确定糖与苷元及糖与糖的连接位置，单糖绝对构型分析和端基核磁共振特征进一步确定糖残基的立体化学。

        完整结构中的每一项信息对应相应层级的实验依据。分子式、苷元、糖组成、连接位置和端基构型相互吻合后，未知糖苷的完整结构得到确定。

7 未知糖苷分子式、糖组成、糖链连接与苷键构型鉴定相关代表化学品

表1 新橙皮糖苷型与芸香糖苷型二氢黄酮结构对照

表2 黄酮、黄酮醇苷元及糖苷连接位置结构对照

表3 组成糖与二糖结构对照化合物

表4 酸水解、糖绝对构型、核磁共振与色谱质谱分析试剂

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参考文献

[1] Amakura Y, Yoshimura M, Yamakami S, Yoshida T, Wakana D, Hyuga M, Hyuga S, Hanawa T, Goda Y. Characterization of Phenolic Constituents from Ephedra Herb Extract. Molecules, 2013, 18(5): 5326–5334. DOI: 10.3390/molecules18055326.

[2] Kind T, Fiehn O. Metabolomic database annotations via query of elemental compositions: Mass accuracy is insufficient even at less than 1 ppm. BMC Bioinformatics, 2006, 7: 234. DOI: 10.1186/1471-2105-7-234.

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