染色质层面的表观遗传调控是连接基因组序列与细胞表型的关键环节。随着高通量测序技术的发展，一系列蛋白–DNA互作与染色质开放状态测定方法相继出现。CUT&Tag(Cleavage Under Targets and Tagmentation)在完整细胞或细胞核水平，利用抗体引导转座酶原位切割并标记目标蛋白附近DNA，在低起始细胞量条件下实现高信噪比的结合位点解析，在组蛋白修饰、转录因子结合及微量样本表观遗传研究中表现出显著优势。

关键词

CUT&Tag；ChIP-seq；ATAC-seq；染色质调控；表观遗传学

一、CUT&Tag技术原理与方法学定位

1.1 基本原理

CUT&Tag(Cleavage Under Targets and Tagmentation)的核心可以概括为“抗体导航+Tn5定点剪切+接头一体化插入”：

（1）靶标识别

特异性一抗识别目标蛋白(例如特定组蛋白修饰或转录因子)，二抗或融合蛋白将蛋白A/G与Tn5转座酶“带”到目标位点附近。

（2）原位剪切与标签化

在适当条件下激活Tn5后，其携带的测序接头在目标蛋白结合位点附近完成tagmentation，生成以核小体尺度为主的片段分布（常见约150 bp单核小体及其倍数，如约300 bp双核小体；不同靶标与反应条件会改变分布），随后经PCR补全接头并扩增得到测序文库。

（3）在细胞或细胞核内完成反应

整个过程通常在完整细胞或分离的细胞核中进行，一般不需要甲醛交联和超声打断，减少了结构扰动与背景片段的产生。

1.2 与ChIP-seq和ATAC-seq的关系

从方法学谱系看，CUT&Tag位于“蛋白靶向+原位转座”这一支路，和ChIP-seq、ATAC-seq相互补充：

（1）与ChIP-seq的对比

① ChIP-seq依赖交联+超声打断+免疫沉淀，流程长、样本需求高，背景片段多；

② CUT&Tag在天然或准天然条件下直接在靶点附近剪切，背景显著降低，可在约1000个细胞量级甚至单细胞条件下工作；

③ 两者在“能否检测到、峰形是否一致”层面具有较高可比性，但CUT&Tag在低丰度靶标和微量样本上的优势更明显。

（2）与ATAC-seq的对比

① ATAC-seq通过Tn5直接标记开放染色质，输出的是“可及性图谱”，不区分具体蛋白；

② CUT&Tag将Tn5“带”到特定蛋白周围，输出的是“某种蛋白或修饰的结合图谱”；

③ 两者联合可同时回答“哪里开放”“谁在这些区域工作”两个问题。

（3）技术优势对比

（4）实验流程对比

ChIP-seq（典型流程）

① 交联（可选：TF常交联；部分组蛋白修饰也可不交联/轻交联）

② 细胞裂解/取细胞核

③ 染色质剪切（超声或MNase等）

④ 抗体免疫沉淀（IP）+ 磁珠捕获/多轮洗涤

⑤ 解交联 + 蛋白酶处理

⑥ DNA纯化

⑦ 建库（末端修复/加接头/大小选择）或先建库后富集（视方案）

⑧ PCR扩增 → 测序 → 比对/去重/peak calling/质控

CUT&Tag（典型流程）

① 细胞/细胞核温和处理并固定在载体/磁珠（常见为ConA磁珠）

② 一抗结合（识别TF/组蛋白修饰）

③ 二抗结合（增强结合/桥接，依方案而定）

④ 加入 pA/pAG-Tn5（预装接头）并结合到抗体复合物

⑤ 激活tagmentation（在靶点附近插入接头并断裂）

⑥ 释放DNA片段（裂解/终止反应）

⑦ PCR扩增（同时补全接头并加index）

⑧ 纯化/大小选择 → 测序 → 比对/peak calling/质控

ATAC-seq（典型流程）

① 细胞核制备（关键：温和裂解、保留染色质结构）

② Tn5转座反应（tagmentation：开放区插入接头并断裂）

③ 纯化DNA（或直接进入后续，视试剂体系）

④ PCR扩增（加index并放大文库）

⑤ 纯化/大小选择（可选）

⑥ 测序 → 比对/过滤线粒体reads → peak calling/footprinting/核小体分析

二、CUT&Tag实验设计的思路框架

2.1 适用样本与靶标类型

（1）样本类型

① 细胞系与原代细胞：起始量可以显著低于ChIP-seq，适合难以大量扩增的原代细胞或稀有群体；

② 组织样本：通常需要先制备单细胞或细胞核悬液，再进入CUT&Tag流程；

③ 特殊样本(如冷冻生物样本)：可在适当复苏和轻度预处理后进入反应，但需特别关注DNA完整性。

（2）靶标类型

① 组蛋白修饰：H3K4me3、H3K27ac等富集于启动子或增强子位置，是当前最成熟的应用方向之一；

② 转录因子：适合研究具有相对稳定结合位点的TF，但对于结合时间短、亲和力低的因子仍需仔细优化条件；

③ 其他染色质相关蛋白：例如转录共激活因子、染色质重塑复合体成员等。

2.2 抗体与转座酶相关考量

（1）抗体选择与验证

① 抗体质量直接决定信噪比，通常优先选择已有ChIP或CUT&Tag文献验证的抗体；

② 建议在上线前至少通过Western blot或免疫荧光确认靶标特异性与表达水平；

③ 对于新靶点，往往需要多只抗体并行筛选，结合试验峰形与阴性对照结果综合评估。

（2）pA/G-Tn5转座酶特性

① 预装接头的Tn5是CUT&Tag的“核心酶学引擎”，不同批次活性差异可能导致片段长度分布与文库复杂度变化；

② 需要通过时间梯度和酶量梯度小试，确定既能获得清晰峰形又不产生过度随机剪切的反应条件。

2.3 对照与批次设计

（1）阴性对照

① IgG对照：评估非特异性抗体结合与Tn5背景切割；

② 无抗体对照：评估转座酶在无抗体引导情况下的背景分布。

（2）阳性对照

选择在多数细胞类型中都有明确峰形的标记(如H3K4me3)，用以评估样本质量、酶活性与整体流程是否正常。

（3）生物学重复与批次效应

对于差异峰分析尤其重要，通常至少需要2–3个生物学重复，并尽量在实验设计阶段就错配批次与条件，降低系统偏倚。

三、CUT&Tag数据特征与分析路径

3.1 数据特征与质控要点

（1）文库特征

① 片段长度分布通常在几百bp内，可呈现一定的核小体周期性；

② 文库复杂度与测序深度决定可解析的峰数量与精度，低起始样本量时尤其需要关注重复reads比例。

（2）质控指标

① 测序原始质量(Q值分布、GC含量)；

② 比对率及独特比对率；

③ 线粒体reads比例(过高可能提示细胞核完整性或操作问题)；

④ FRiP等信号占比指标，用于衡量富集效率。

3.2 标准分析流程概览

（1）比对与过滤

使用合适的比对软件对reads进行基因组比对，过滤低质量比对、重复reads及黑名单区域信号。

（2）peak calling

根据不同靶标特征选择合适的算法与参数，如尖锐峰(转录因子)与宽峰(某些组蛋白修饰)通常需要不同设置。

（3）功能注释

peak与基因组功能元素关联

① 注释到启动子、增强子、内含子、间隔区等不同区域；

② 统计不同区域的峰分布特征，用于推断靶标的功能偏好。

motif与调控网络分析

① 对转录因子类靶标可进行motif富集分析，解析DNA序列偏好；

② 与已知motif数据库比对，推测可能协同或竞争的调控因子。

差异峰分析与多组学整合

① 在不同处理条件或不同细胞群体之间进行差异峰分析，识别条件特异性调控位点；

② 将差异峰关联到对应基因，结合RNA-seq的差异表达结果进行交叉验证；

③ 如有ATAC-seq数据，可进一步区分“开放但未被该蛋白占据”与“开放且被特定蛋白占据”的调控区域。

四、应用场景与发展趋势

4.1 典型应用场景

（1）组蛋白修饰景观构建

① 在有限样本甚至临床微量样本上描绘H3K27ac、H3K4me3等修饰图谱，解析疾病相关表观调控变化；

② 在细胞命运转换、重编程或分化过程中，追踪关键修饰的时间动态。

（2）转录因子结合位点与增强子解析

① 解析特定转录因子在基因组上的结合分布，结合ATAC-seq与转录组结果定义功能性增强子；

② 比较不同条件(药物处理、基因敲除等)下结合位点变化，定位调控网络中的关键节点。

（3）有限样本与单细胞层面的表观调控

① 利用CUT&Tag的低起始量特性，在稀有细胞群或有限病理样本上开展研究；

② 基于改进流程发展single cell CUT&Tag，有望在细胞异质性背景下解析表观调控的细胞型特异模式。

4.2 技术优势与现实局限

（1）优势概括

① 样本需求量低，适合微量和珍贵样本；

② 无需传统交联和超声打断，流程简化且背景显著降低；

③ 高空间分辨率，峰边界清晰，有利于精确定位调控元件。

（2）关键局限

① 抗体依赖性强，新靶点必须经过充分验证；

② 对某些结合时间短或亲和力弱的因子，未交联状态下可能难以捕获全部真实结合事件；

③ pA/G-Tn5制备与质量控制对实验室条件有一定要求，商业酶成本也需要纳入整体项目预算。

4.3 未来发展方向

（1）流程自动化与标准化

通过模块化试剂体系与自动化平台，将CUT&Tag转化为高通量、可跨实验室复现的标准化流程。

（2）多组学一体化方案

探索与ATAC-seq、RNA-seq、Hi-C等技术的联合设计，构建在同一样本或同一细胞水平上多层信息协同的实验框架。

（3）临床转化潜力

在血液肿瘤、实体瘤微量活检样本及干细胞治疗产品质控中，CUT&Tag有望作为表观标志物检测的技术候选之一，但仍需要围绕成本、通量和法规合规性进行系统评估。

五、阿拉丁相关产品

          CUT&Tag技术在方法学上实现了从“先打碎再富集”到“原位剪切并即时标签化”的跃迁，为解析蛋白-DNA互作提供了一条更高信噪比、更适合微量样本的技术路径。对于关注表观调控、转录网络、细胞命运决策及疾病相关调控异常的研究者而言，在项目设计阶段系统评估CUT&Tag与ChIP-seq、ATAC-seq等技术的组合使用，将有助于在成本、分辨率与样本需求之间找到更优平衡。

阿拉丁：https://www.aladdin-e.com/