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寡核苷酸化学合成中的偶联活化剂、核苷砌块与修饰设计：对合成效率、纯度和性质的影响
寡核苷酸化学合成中的偶联活化剂、核苷砌块与修饰设计：对合成效率、纯度和性质的影响
1. 寡核苷酸化学合成要解决哪些问题
寡核苷酸化学合成的任务，不只是按顺序把单体连接起来，还包括提高全长产物比例、减少缺失序列和其他杂质、保证后处理后结构完整，并使最终产物具有预期的杂交、稳定性或生物学性质。对实验而言，需要判断两类问题：一类是合成过程是否顺利，另一类是产物性质是否符合用途。前者主要与脱保护、偶联、封端和骨架转化有关，后者更多取决于核苷砌块和修饰设计。
常用的核苷亚磷酰胺法之所以长期作为主流路线，是因为它能在固相载体上按循环方式逐步延长链段，并在每一步后清除未反应试剂，便于控制反应效率和杂质来源。
2. 核苷亚磷酰胺固相合成的基本循环
常规寡核苷酸固相合成通常按去 5′-端 DMTr 保护、偶联、封端、氧化或硫化的顺序循环进行。这个框架适用于多数常规 DNA 合成，也是后续讨论活化剂和修饰核苷时的基础。
步骤 | 步骤作用 | 主要风险 |
脱保护 | 去除 5′ 端二甲氧基三苯甲基保护基，释放新的 5′ 羟基 | 脱保护不完全会影响下一轮偶联；酸处理过强或时间过长会增加去嘌呤风险 |
偶联 | 使活化后的核苷亚磷酰胺与链端 5′ 羟基反应，形成新的链间连接 | 偶联效率不足会降低全长产物比例 |
封端 | 封闭未反应的 5′ 羟基，阻止失败链继续延长 | 封端不足会增加缺失序列并加重后续分离难度 |
氧化或硫化 | 将三价磷中间体转为较稳定的五价磷结构，或转为含硫骨架 | 转化不完全会带来骨架不均一和结构杂质 |
关键判断: 偶联和封端主要影响缺失序列，脱保护主要影响酸损伤风险，氧化或硫化主要影响骨架完整性。如果目标是天然磷酸二酯骨架，通常采用氧化；如果目标是磷代硫酸酯骨架，则需要把这一步改为硫化。
3. 偶联活化剂的作用与选用要点
核苷亚磷酰胺单体本身的反应性有限，通常需要偶联活化剂促进形成更易与 5′ 羟基反应的活性中间体。四唑及其衍生物、4,5-二氰基咪唑等体系，都是围绕这一目的发展起来的。活化剂的差异不仅体现在反应速度上，也会影响偶联完成度、副反应和对不同单体的适应性。
活化剂影响明显的情况主要有三类。
1) 第一类是位阻较大或结构较复杂的单体，这类单体本身偶联较慢，对活化条件更敏感。
2) 第二类是带有糖环、碱基或骨架修饰的单体，标准条件下不一定都能保持稳定的偶联效率。
3) 第三类是较长序列的合成，因为单轮偶联效率即使只下降一点，累积到多轮后也会显著拉低全长产物比例。
因此，遇到全长比例偏低、特定单体引入困难或长链后段明显掉率时，优先检查的不应只是单体本身，还应同时查看活化剂类型、溶剂和体系含水量、偶联时间以及单体过量倍数。对于难偶联单体，先优化活化条件，通常比一开始就更换整套单体体系更有针对性。
4. 核苷砌块与修饰类型对产物性质的影响
核苷砌块和修饰设计主要影响的是产物的稳定性、识别行为、蛋白相互作用和最终用途，而不只是合成过程中能否完成链延长。对寡核苷酸而言，常见修饰大致可分为糖环修饰、碱基修饰和骨架修饰三类，这三类修饰关注的重点并不相同。
修饰类型 | 主要影响 | 常见意义 |
糖环修饰 | 构象、杂交能力、核酸酶耐受性 | 调整结合能力和稳定性 |
碱基修饰 | 配对识别、标记、特殊相互作用 | 用于检测、成像或特异识别 |
骨架修饰 | 化学稳定性、蛋白结合、体内行为 | 调整抗降解能力及生物学表现 |
其中，磷代硫酸酯骨架是最常见的一类骨架修饰。它常用于提高抗核酸酶降解能力，但同时也会改变与蛋白的相互作用，从而影响细胞摄取、组织分布、活性和毒性相关表现。糖环修饰则常用于进一步调节稳定性和杂交性质。修饰核苷和修饰骨架的意义在于把产物的化学性质和应用表现调到所需范围内。
5. 实验中如何判断先优化活化条件还是先调整单体设计
实验排查时，重要的是先分清问题属于合成过程，还是属于分子设计。
实验现象 | 优先检查方向 | 判断重点 |
全长产物比例低，缺失序列偏多 | 先检查偶联和封端 | 偶联是否充分，封端是否有效阻断失败链延长 |
同一条序列前段正常、后段明显掉率 | 先检查步进收率和活化条件 | 长链合成中小幅掉率会累积放大 |
富嘌呤序列或酸敏感序列损伤明显 | 先检查脱保护条件 | 酸种类、浓度和接触时间是否合适 |
修饰单体引入困难 | 先检查活化剂与偶联时间 | 标准活化条件是否足以覆盖该单体 |
纯度尚可，但耐降解性不足 | 优先检查骨架和糖环修饰 | 这类问题通常不是活化剂造成的 |
化学分析合格，但功能表现不理想 | 优先检查修饰设计与用途匹配 | 需要回到杂交、识别或体内行为上判断 |
小结：化学延长效率的问题，优先从工艺条件查；产物性质和用途的问题，优先从核苷砌块和修饰设计查。
6. 合成中的关键操作控制点
6.1 水分控制
核苷亚磷酰胺单体和活化体系都对水分敏感。水分进入体系后，会消耗活性组分并降低有效偶联，从而影响全长产物比例。对修饰单体和较长序列，这个问题通常更明显。
6.2 脱保护条件
去 5′-DMTr 保护的目的是释放 5′ 羟基，但条件并非越强越好。已有去嘌呤动力学研究表明，酸种类、浓度、溶剂和接触时间都会影响去嘌呤与去 DMTr 的平衡，因此在保证去保护充分的同时，还要尽量减少酸损伤，尤其是对富嘌呤序列和较长序列。
6.3 封端控制
封端的作用是及时封闭未反应链的 5′ 羟基，避免这些链在下一轮继续延长并形成难以分离的缺失序列。缺失杂质偏高时，不能只看偶联是否充分，也要检查封端是否有效。
6.4 骨架转化
天然磷酸二酯骨架通常通过氧化得到稳定结构；磷代硫酸酯骨架则依赖硫化步骤形成目标连接。如果这一步转化不充分，会造成骨架不均一，影响纯度和结构一致性。
6.5 后处理兼容性
有些问题并不发生在偶联阶段，而是出现在切割、脱保护和纯化阶段。某些修饰单体虽然可以完成偶联，但未必能耐受常规后处理条件。因此，在选择修饰核苷时，除了看偶联效率，还要同时评估其与后处理条件的兼容性。
7. 寡核苷酸化学合成中的关键试剂与核苷砌块：代表化学品分类、特色与应用（表1—表4）
表1｜核苷与脱氧核苷原料
分类 | Cas编号 | 阿拉丁货号 | 名称 | 规格或纯度 | 产品特色与应用 |
RNA核苷原料（腺嘌呤） | 58-61-7 | 腺苷 | PharmPure™,USP,内毒<1000EU/g;微生物限度≤100cfu/g | 可作为核糖核苷单体或修饰核苷合成前体，用于 RNA 相关单体、标记核苷或功能化核苷的前体研究 | |
RNA核苷原料（胞嘧啶） | 65-46-3 | 胞嘧啶核苷 | Moligand™, ≥99% | 可用于胞嘧啶类核糖核苷单体制备，也可用于修饰核苷、核苷类似物和核酸化学研究 | |
RNA核苷原料（鸟嘌呤） | 118-00-3 | 鸟苷 | PharmPure™,USP,内毒<500EU/g;微生物限度≤100cfu/g | 可作为鸟嘌呤核糖核苷前体，用于 RNA 单体制备、修饰核苷设计及核酸结构研究 | |
RNA核苷原料（尿嘧啶） | 58-96-8 | 尿核甙 | UltraBio™, ≥99% | 可作为尿嘧啶核糖核苷前体，用于 RNA 单体合成、2′位修饰核苷制备和寡核苷酸化学研究 | |
DNA脱氧核苷原料（腺嘌呤） | 958-09-8 | 2'-脱氧腺苷(无水) | Moligand™, ≥98%(HPLC)(T) | 用于制备脱氧腺苷亚磷酰胺单体，是 DNA 固相合成和修饰单体开发的常用前体 | |
DNA脱氧核苷原料（胞嘧啶） | 951-77-9 | 2’-脱氧胞苷 | ≥99% | 用于制备脱氧胞苷亚磷酰胺单体，也可用于 DNA 修饰砌块和核苷类似物研究 | |
DNA脱氧核苷原料（鸟嘌呤） | 961-07-9 | 2′-脱氧鸟苷 水合物 | ≥99% | 用于制备脱氧鸟苷亚磷酰胺单体，适用于鸟嘌呤位点引入及相关保护基路线研究 | |
DNA脱氧核苷原料（胸腺嘧啶） | 50-89-5 | 胸苷 | PharmPure™,USP,内毒<50EU/g;微生物限度≤100cfu/g | 可作为脱氧胸苷单体前体，用于 DNA 亚磷酰胺单体制备和寡核苷酸链延长研究 |
表2｜标准 DNA 亚磷酰胺单体
分类 | Cas编号 | 阿拉丁货号 | 名称 | 规格或纯度 | 产品特色与应用 |
标准DNA亚磷酰胺单体（dA） | 98796-53-3 | DMT-dA(Bz)亚磷酰胺 | ≥99%, mixture of isomers | 用于固相合成中腺嘌呤位点引入，是常规 DNA 序列组装的标准砌块之一 | |
标准DNA亚磷酰胺单体（dC） | 102212-98-6 | DMT-dC(bz)亚磷酰胺单体 | ≥99% | 用于固相合成中胞嘧啶位点引入，常用于常规 DNA 序列和修饰序列的链延长 | |
标准DNA亚磷酰胺单体（dG，异丁酰保护） | 93183-15-4 | DMT-dG(Ib)亚磷酰胺 | ≥99% | 用于固相合成中鸟嘌呤位点引入，适用于按碱基保护基体系选择脱保护条件的 DNA 合成路线 | |
标准DNA亚磷酰胺单体（dG，N2-二甲基甲脒保护） | 330628-04-1 | DMT-dG(dmf) 亚磷酸酰胺 | ≥98% | 用于鸟嘌呤位点引入，可用于比较不同鸟嘌呤保护策略对合成效率和后脱保护条件的影响 | |
标准DNA亚磷酰胺单体（dT） | 98796-51-1 | DMT-dT亚磷酰胺单体 | ≥99% | 用于固相合成中胸腺嘧啶位点引入，是常规 DNA 单体体系中的基础砌块 |
表3｜偶联活化剂与亚磷酰胺构建试剂
分类 | Cas编号 | 阿拉丁货号 | 名称 | 规格或纯度 | 产品特色与应用 |
四氮唑类偶联活化剂 | 288-94-8 | 四氮唑 | ≥98% | 经典偶联活化剂，用于活化亚磷酰胺单体并促进其与链端 5′位羟基偶联 | |
四氮唑类偶联活化剂 | 89797-68-2 | 5-乙硫基四氮唑（ETT） | ≥98% | 用于亚磷酰胺偶联活化，常见于难偶联单体、RNA 单体或修饰寡核苷酸条件筛选 | |
四氮唑类偶联活化剂 | 21871-47-6 | 5-苄硫基四氮唑 | ≥98.5% | 用于亚磷酰胺偶联活化，可用于提高部分位阻较大单体或修饰单体的偶联反应完成度 | |
咪唑类偶联活化剂 | 1122-28-7 | 4，5-二氰基咪唑(DCI) | ≥99% | 用于亚磷酰胺偶联活化，适用于常规单体与部分修饰单体的偶联条件开发 | |
亚磷酰胺化试剂 | 89992-70-1 | 2-氰乙基N,N-二异丙基氯亚磷酰胺 | ≥95% | 用于将核苷前体转化为亚磷酰胺单体，是制备 DNA、RNA 及修饰寡核苷酸砌块的关键试剂 |
表4｜去保护、封端、氧化/硫化、后处理与关键溶剂
分类 | Cas编号 | 阿拉丁货号 | 名称 | 规格或纯度 | 产品特色与应用 |
合成主溶剂 | 75-05-8 | 无水乙腈(ACN) | 无水级, ≥99.8%, H2O≤0.003% | 常用于亚磷酰胺单体、活化剂和自动合成体系配制，也是固相合成中的常用无水介质 | |
封端体系碱组分/反应溶剂 | 110-86-1 | 吡啶 | 无水级, ≥99.8% | 常用于封端体系和单体合成过程中的碱性介质，可参与调节反应环境和试剂溶解性 | |
单体合成/无水反应溶剂 | 109-99-9 | 四氢呋喃(THF) | 无水级,≥99.9%,无稳定剂，H2O≤30ppm | 常用于核苷磷酰胺化、单体制备及相关无水反应体系配制 | |
去二甲氧基三苯甲基保护基试剂 | 79-43-6 | 二氯乙酸（DCA） | AR, ≥98% | 用于去除 5′端二甲氧基三苯甲基保护基，释放链端羟基进入下一轮偶联 | |
去二甲氧基三苯甲基保护基试剂 | 76-03-9 | 三氯乙酸(TCA) | 欧洲药典（Ph.Eur）, 适用于分析, ACS, 优级品 | 用于去除 5′端二甲氧基三苯甲基保护基，可用于脱保护条件比较和工艺筛选 | |
封端乙酰化试剂 | 108-24-7 | 醋酸酐(易制毒) | 欧洲药典（Ph.Eur）,puriss. p.a.,ISO,ACS,≥99%(GC) | 用于封闭未反应的 5′位羟基，减少缺失链继续延长形成的短链杂质 | |
封端助剂 | 616-47-7 | 1-甲基咪唑 | ≥99% | 常作为封端体系助剂，与乙酰化试剂配合使用以完成未反应位点封闭 | |
氧化试剂 | 7553-56-2 | 碘 | 高级纯, 试剂级, ≥99.8%(T) | 用于将偶联后形成的三价磷中间体氧化为五价磷骨架，是常规磷酸二酯寡核苷酸合成中的关键试剂 | |
硫化试剂 | 66304-01-6 | 3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物 | Moligand™,≥98% | 用于将亚磷酸酯中间体转化为磷代硫酸酯键，适用于含硫骨架寡核苷酸制备 | |
硫化试剂 | 15088-78-5 | 双(苯乙酰)二硫化物 | ≥98%(HPLC) | 用于磷代硫酸酯骨架构建，可作为含硫寡核苷酸合成中的硫转移试剂 | |
切割/脱保护试剂 | 1336-21-6 | 氨水 | 优级试剂, 25-28% | 用于将寡核苷酸从固相载体上切下，并去除碱基和磷酸保护基 | |
快速切割/脱保护体系组分 | 74-89-5 | 甲胺(易制爆) | AR，30-33 wt. % 乙醇溶液 | 常用于氨水/甲胺快速切割与脱保护体系配制，可缩短寡核苷酸从固相载体切割及碱基脱保护时间；适用于快速后处理条件开发，使用时需结合碱基保护基和修饰单体兼容性评估 |
参考文献
[1] Beaucage S. L., Caruthers M. H. Deoxynucleoside phosphoramidites: A new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis. Tetrahedron Letters. 1981;22(20):1859-1862.
[2] Wei X. Coupling activators for the oligonucleotide synthesis via phosphoramidite approach. Tetrahedron. 2013;69(18):3615-3637.
[3] Septak M. Kinetic studies on depurination and detritylation of CPG-bound intermediates during oligonucleotide synthesis. Nucleic Acids Research. 1996;24(15):3053-3058.
[4] Khvorova A., Watts J. K. The chemical evolution of oligonucleotide therapies of clinical utility. Nature Biotechnology. 2017;35:238-248.
[5] Clavé G., Reverte M., Vasseur J.-J., Smietana M. Modified internucleoside linkages for nuclease-resistant oligonucleotides. RSC Chemical Biology. 2021;2:94-150.
[6] Crooke S. T., Vickers T. A., Liang X.-H. Phosphorothioate modified oligonucleotide-protein interactions. Nucleic Acids Research. 2020;48(10):5235-5253.
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