氰基-3-酪酰胺（Cyanine 3 Tyramide）：TSA 信号放大原理、应用及实验选型指南
氰基-3-酪酰胺（Cyanine 3 Tyramide）：TSA 信号放大原理、应用及实验选型指南
氰基-3-酪酰胺（Cyanine 3 Tyramide）基础信息一览
项目 | 信息 |
中文名称 | 氰基-3-酪酰胺 |
英文名称 | Cyanine 3 Tyramide |
常用简称 | Cy3 Tyramide；Tyramide-Cy3；Cy3TSA 等 |
CAS 号 | 174961-75-2 |
分子式 | C₃₉H₄₇N₃O₈S₂ |
分子量 | 约 749.94 g/mol |
本质/结构特点 | 由Cy3荧光团与酪酰胺（tyramide）偶联而成的小分子荧光底物，用作HRP催化的酪酰胺信号放大底物。 |
荧光类型 | 橙色荧光花菁染料（Cy3 类），适配“Cy3/TRITC通道”成像。 |
激发峰（Ex） | 约 550 nm（Cy3-tyramide TSA 体系实测峰值） |
发射峰（Em） | 约 570 nm（橙-橙红色荧光） |
外观 | 棕色至黑色固体粉末 |
溶解性 | 在DMSO中溶解度约16 mM，易溶；在多数有机溶剂（如DMF、THF等）中也可溶，水中溶解性有限，通常先配DMSO储备液再稀释入缓冲液。 |
推荐储存条件 | 干燥、避光；–20 ℃ 保存为主流推荐（有文献/厂商建议 –80 ℃ 可长期保存）；避免反复冻融。 |
主要用途 | 作为HRP催化的酪酰胺信号放大（TSA）荧光底物，用于增强：免疫组织化学（IHC）、免疫细胞化学（ICC）、原位杂交（ISH/FISH）以及其他需要高灵敏度的免疫分析信号。 |
工作原理概要 | HRP在低浓度H₂O₂存在下，催化Cy3-tyramide生成活性自由基；自由基与靶标周围蛋白上的酪氨酸等残基共价结合，在靶点附近沉积大量Cy3荧光团，实现10–100倍量级的信号放大。 |
典型检测平台 | 高灵敏 IHC/ICC、ISH/FISH、多重荧光成像、多重免疫组化，以及高灵敏度病原或低丰度蛋白分析体系。 |
使用限制 | 一般为仅供科研使用，不用于诊断或治疗。 |
工作原理：为什么它能“放大信号”？
Cy3 Tyramide之所以重要，是因为它参与了一种叫酪酰胺信号放大（Tyramide Signal Amplification，TSA）的技术。
1. TSA的核心思路
TSA是一种酶学信号放大技术：
1. 体系中有HRP（辣根过氧化物酶）标记在抗体或探针上；
2. 加入含有 酪酰胺-荧光团（如 Cy3 Tyramide）和过氧化氢（H₂O₂）的工作液；
3. HRP催化酪酰胺发生氧化，生成活性中间体；
4. 这些活性中间体会在HRP附近与蛋白质上的酪氨酸等残基共价结合，从而把大量Cy3荧光团“沉积”在靶标周围
结果就是：
原本只有“一份抗体”带着有限的荧光，现在变成“一份抗体 + 一团沉积荧光云”，信号被成倍甚至上百倍放大。
文献和厂商资料中显示，使用TSA可以将某些免疫检测的灵敏度提高10–100倍甚至更高，显著降低可检测的最低靶标丰度。
2. 和“普通荧光二抗”相比有什么不同？
传统免疫荧光：
- (a) 每个靶标位点 ≈ 几个二抗 × 每个二抗一个荧光团 → 信号有限
TSA（以 Cy3 Tyramide 为例）：
- (b) 每个HRP位点可以催化“多分子Cy3 Tyramide”沉积 → 在靶标周围形成高密度的共价荧光层，信号被显著放大，同时由于共价结合，耐洗、抗脱色
Cy3 Tyramide（TSA）主要应用一览表
应用类型 | 典型样本/靶标 | 采用Cy3 Tyramide TSA的优势 |
免疫组织化学IHC | FFPE或冰冻组织切片；低丰度信号通路蛋白（如Notch通路成分、核受体、转录因子等） | 显著提升弱表达蛋白的染色强度，使原本“几乎不可见”的核内/细胞内靶点可以清晰成像；保持亚细胞定位。 |
免疫细胞化学ICC | 贴壁细胞或悬浮细胞；弱表达受体、转录因子、信号分子等。 | 用较低一抗浓度即可获得强烈荧光信号，减少细胞样本用量；适合共聚焦高分辨率观察。 |
原位杂交 ISH/FISH | 组织或细胞中的DNA / RNA探针检测：低拷贝基因、低表达 mRNA、病毒基因组等。 | 借助HRP标记探针或抗DIG/生物素抗体，将Cy3-tyramide沉积在杂交位点，显著提升低拷贝核酸信号，可实现多色FISH。 |
多重免疫荧光/多重IHC /组织空间成像 | 同一张FFPE或冰冻切片上对多种免疫标志物进行多轮染色（肿瘤免疫微环境分析、多标志物诊断面板等）。 | TSA染色后，荧光信号共价固定，后续可剥离抗体再做下一轮染色；结合不同颜色酪酰胺（含 Cy3），可实现 5–7 色甚至更多标记；非常适合高维度mIHC/mIF。 |
高灵敏免疫分析&病原检测 | 食品、环境和生物样本中病原菌、毒素或低浓度蛋白（如 E. coli O157:H7 检测等）。 | TSA与免疫磁分离等富集手段联合，可大幅降低检测限，使低污染水平下的病原也可被快速检测；适合构建高灵敏ELISA / 免疫分析体系。 |
神经解剖、受体定位等高难度靶点 | 脑组织中低丰度受体（如AR、ER等）、神经通路示踪、复杂组织结构的弱信号标记。 | TSA对低表达核受体等标志物的免疫染色有显著增强作用，使原本难以染出的区域（如前额叶皮层中的 AR）能被可靠观测。 |
实验小贴士与注意事项
1. 信号放大 ≠ 越强越好
(1) TSA的放大能力很强，如果一抗浓度太高 + TSA反应时间过长，可能出现：
(a) 非特异背景、高背景荧光；
(b) 某些区域“过曝”，细节丢失。
(2) 建议：
(a) 先优化一抗稀释度（通常比传统免疫荧光更稀）；
(b) 梯度测试TSA反应时间，找到“信号和背景的平衡点”。
2. 内源性HRP/过氧化酶的干扰
(1) 组织中天然存在过氧化酶活性（如血细胞、部分组织），若封闭不充分，会导致非特异沉积。
(2) 因此，充分的H₂O₂封闭是TSA实验的关键一步。
3. 多重染色顺序的设计
(1) 通常会把最弱的靶标放在前几轮TSA染色中，以充分放大信号；
(2) 多轮TSA时要考虑：
(a) 不同颜色荧光的光谱重叠（Cy3 与 TRITC 类似）；
(b) 抗原修复和高温处理是否会影响前一轮已沉积的荧光或组织结构。
4. 定量分析时要谨慎
(1) TSA 的特点是“非线性放大”：沉积效率受HRP活性、底物浓度、时间等多因素影响；
(2) 在做定量比较（如不同样本表达量）时，必须确保：
(a) 同一批次样本使用完全一致的染色条件；
(b) 设立合适的阴阳性对照；
(c) 更建议用于“半定量+定位”，而不是精确定量。
阿拉丁-相关产品
阿拉丁货号 | 品名（中文） | 级别和纯度 | CAS 号 |
氰基-3-酪酰胺Tyramide-Cy3 | ≥95%(HPLC) | 174961-75-2 | |
乳过氧化物酶 来源于牛奶 | EnzymoPure™, ≥35 units/mg dry weight | 9003-99-0 | |
辣根过氧化物酶(HRP) | EnzymoPure™, ≥250 U/mg，Rz≥3 | 9003-99-0 | |
辣根过氧化物酶(HRP) | EnzymoPure™, ＞100 U/mg邻苯三酚，Rz＞1 | 9003-99-0 | |
辣根过氧化物酶(HRP) | EnzymoPure™, ≥150 U/mg powder, Rz≥1.5 | 9003-99-0 | |
辣根过氧化物酶(HRP) | EnzymoPure™, ＞200 U/mg, RZ 2-4 | 9003-99-0 | |
辣根过氧化物酶(HRP) | EnzymoPure™, ＞150 U/mg，Rz＞2 | 9003-99-0 | |
过氧化物酶 来源于辣根 | Type I, essentially salt-free, lyophilized powder,≥50 units/mg solid (using pyrogallol) | 9003-99-0 | |
过氧化物酶 来源于辣根 | Type X, ammonium sulfate suspension | 9003-99-0 | |
过氧化物酶 来源于辣根(EIA级,纯化) | EnzymoPure™, RZ 2.9,≥500 units/mg protein | 9003-99-0 | |
过氧化物酶 来源于辣根（HRP） | EnzymoPure™, ≥180 U/mg powder, Rz≥2.0 | 9003-99-0 | |
过氧化氢溶液（H₂O₂） | AR 30 wt. % in H2O | 7722-84-1 | |
过氧化氢溶液（H₂O₂） | GR 30 wt. % in H2O | 7722-84-1 | |
过氧化氢溶液（H₂O₂） | ACS 30 wt. % in H2O, contains stabilizer | 7722-84-1 | |
过氧化氢溶液（H₂O₂） | Moligand™ 含有抑制剂, 30 wt. % in H2O, meets USP testing specifications | 7722-84-1 | |
过氧化氢溶液（H₂O₂） | 适用于微生物学 3% | 7722-84-1 | |
过氧化氢溶液（H₂O₂） | Moligand™ 主要成份：3%-3.5%过氧化氢 | 7722-84-1 | |
二甲基亚砜（DMSO） | UltraBio™ 分子生物学级 ≥99.5%(GC) | 67-68-5 | |
二甲基亚砜（DMSO） | 分子生物学级 ≥99.9% | 67-68-5 | |
N,N-二甲基甲酰胺（DMF） | 适用于多肽合成 | 68-12-2 | |
N,N-二甲基甲酰胺（DMF） | 分子生物学级 ≥99.9% | 68-12-2 | |
N,N-二甲基甲酰胺（DMF） | 无水级 ≥99.8% | 68-12-2 | |
四氢呋喃（THF） | 超干级 ≥99.9% H2O≤50ppm, 无稳定剂 | 109-99-9 | |
四氢呋喃（THF） | 无水级 ≥99.9% 无稳定剂 | 109-99-9 |
参考文献
1. Tocris Bioscience. Cyanine 3 Tyramide – product information.
2. MedChemExpress (MCE). Cyanine 3 Tyramide (Tyramide-Cy3) – datasheet.
3. 翌圣生物（Yeasen）. Cyanine 3 Tyramide 产品说明.
4. Biotium. Tyramide Signal Amplification (TSA) – Technical Note.
5. Tocris Bioscience. Tyramide Signal Amplification (TSA) overview.
6. Bobrow MN, Harris TD, Shaughnessy KJ, Litt GJ. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. J Immunol Methods. 1989;125:279–285.
7. Bobrow MN, Shaughnessy KJ, Litt GJ. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. II. Application to membrane immunoassays. J Immunol Methods. 1991;137:103–112.
8. Sanno N, Osamura RY. Catalyzed reporter deposition method for amplifying endocrine products. Endocr Pathol. 1998;9:195–199.
9. von Gijlswijk RP, et al. Fluorochrome-labeled tyramides: use in immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridization. J Histochem Cytochem. 1997;45:375–382.
10. Springer Protocols. Tyramide Amplification in Immunohistochemistry. 收录于 Methods in Molecular Biology 系列章节。
11. Stack EC, Wang C, Roman KA, et al. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide Signal Amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 2014;70(1):46–58.
12. Gerdes MJ, et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification. J Immunol Methods.
13. Akoya Biosciences. Opal Multiplex IHC Assay Development Guide.
14. Beyotime Biotechnology. 内源性过氧化物酶封闭液（Endogenous Peroxidase Blocking Buffer）说明书.
15. IHC WORLD. Blocking Endogenous Peroxidase. （总结 IHC 实验中利用 3% 或 0.3% H₂O₂ 封闭内源性过氧化物酶的常用做法）
危险品化学品经营许可证（带存储）